Question

【題目】qRT-PCR又稱實(shí)時(shí)熒光定量PCR，是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)定每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物的總量，間接對(duì)待測(cè)樣品中特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)步驟：反轉(zhuǎn)錄→擴(kuò)增→檢測(cè)。qRT-PCR目前主要應(yīng)用于基因表達(dá)水平的檢測(cè)。請(qǐng)回答下列有關(guān)問題：

（1）反轉(zhuǎn)錄：在___________酶的作用下，mRNA反轉(zhuǎn)錄形成cDNA分子；cDNA與原基因相比，在結(jié)構(gòu)上的不同點(diǎn)有_________________________________。

（2）擴(kuò)增：用PCR擴(kuò)增cDNA，首先要制備___________種引物，以便為___________酶提供結(jié)合位點(diǎn)，并從引物的___________（填“5′”或“3′”）端開始拼接單個(gè)的脫氧核苷酸。

（3）檢測(cè)：利用熒光標(biāo)記的化學(xué)物質(zhì)是____________________，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。

（4）qRT-PCR對(duì)基因表達(dá)的檢測(cè)僅限于___________水平，而對(duì)于翻譯水平的檢測(cè)常用的方法是___________。

Answer 1

【答案】逆轉(zhuǎn)錄（或反轉(zhuǎn)錄） cDNA中不具有啟動(dòng)子和終止子等調(diào)控因子 2 熱穩(wěn)定DNA聚合（或Taq） 3′ 4種脫氧核苷酸（或dNTP） 轉(zhuǎn)錄 抗原一抗體雜交實(shí)驗(yàn)

【解析】

1、PCR技術(shù)：

（1）概念：PCR全稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA的核酸合成技術(shù)。

（2）原理：DNA復(fù)制。

（3）前提條件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一對(duì)引物。

（4）條件：模板DNA、四種脫氧核苷酸、一對(duì)引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）。

（5）過程：①高溫變性：DNA解旋過程（PCR擴(kuò)增中雙鏈DNA解開不需要解旋酶，高溫條件下氫鍵可自動(dòng)解開）；低溫復(fù)性：引物結(jié)合到互補(bǔ)鏈DNA上；③中溫延伸：合成子鏈。

（1）由于該技術(shù)是在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，由mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的雙鏈cDNA片段，因此只包含該種生物的部分基因。與原基因相比，缺少原基因結(jié)構(gòu)中的啟動(dòng)子和終止子等調(diào)控因子以及編碼區(qū)的內(nèi)含子等，因此獲得的cDNA與原基因的堿基序列不同。

（2）利用PCR反應(yīng)擴(kuò)增核酸片段，首先要有一段已知的該核酸片段的核苷酸序列，以便以這一核苷酸序列為模板合成引物，因?yàn)?/span>DNA是雙鏈，引物需制備兩種，為熱穩(wěn)定DNA聚合（或Taq）提供結(jié)合位點(diǎn)。由于DNA聚合酶只能從核苷酸鏈的3＇端開始延伸DNA鏈，故引物是從3＇端開始拼接單個(gè)的脫氧核苷酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增。除引物外，PCR反應(yīng)體系中還包含緩沖液、模板DNA、dNTP和Taq 酶等成分。

（3）檢測(cè)PCR產(chǎn)物用到的熒光探針指的是熒光標(biāo)記的4種脫氧核苷酸（或dNTP）。隨著DNA擴(kuò)增次數(shù)的增加，熒光的強(qiáng)度會(huì)逐漸增大，熒光信號(hào)的變化與PCR產(chǎn)物的形成完全同步。

（4）qRT-PCR是以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)定每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物的總量，qRT-PCR對(duì)基因表達(dá)的檢測(cè)僅限于轉(zhuǎn)錄水平。翻譯的產(chǎn)物是蛋白質(zhì)，從分子水平檢測(cè)基因是否翻譯成蛋白質(zhì)的常用方法是抗原-抗體雜交法。