Question

【題目】我國(guó)一科研團(tuán)隊(duì)將小麥液泡膜Na+/K+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（TaNHX2基因）轉(zhuǎn)移到水稻細(xì)胞內(nèi)，獲得了轉(zhuǎn)基因耐鹽水稻新品種�；卮鹣铝杏嘘P(guān)問(wèn)題：

（1）獲取目的基因的方法很多。若TaNHX2基因序列未知，怎樣從已構(gòu)建好的基因文庫(kù)（大腸桿菌作為受體細(xì)菌）中獲取含TaNHX2基因的菌株？______________________________。若已知TaNHX2基因序列，可以用PCR擴(kuò)增該基因。首先根據(jù)序列設(shè)計(jì)、合成__________并投入PCR反應(yīng)體系，同時(shí)，還需要放入dNTP、目的基因、Taq酶等。還可以人工合成TaNHX2基因，如圖1表示人工合成了兩條若干個(gè)堿基的DNA單鏈，兩條鏈通過(guò)18個(gè)堿基對(duì)形成部分雙鏈DNA片段，再利用Klenow酶補(bǔ)平，獲得雙鏈DNA。從功能看，Klenow酶是一種__________酶。

（2）圖2是3種限制酶的識(shí)別與酶切位點(diǎn)示意圖，構(gòu)建基因表達(dá)載體的時(shí)候，經(jīng)BamHⅠ酶切割得到的目的基因可以與圖3所示質(zhì)粒被__________酶切后的產(chǎn)物連接，理由是____________________。連接后的重組質(zhì)粒__________（填“能”、“不能”或“不一定能”）被BamHⅠ切割。

（3）基因表達(dá)載體通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化作用，就可以使目的基因進(jìn)入植物細(xì)胞，并將其__________，使目的基因的遺傳特性得以穩(wěn)定維持和表達(dá)。

Answer 1

【答案】使用高鹽濃度的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，能生存的菌株即含TaNHX2基因的菌株引物DNA聚合BamHⅠ和Sau3AⅠ兩種酶切割片段產(chǎn)生的黏性末端互補(bǔ)不一定插入到植物細(xì)胞的染色體DNA上

【解析】

基因工程技術(shù)的基本步驟：

（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫(kù)中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。

（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。

（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣．將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入�?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。

（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定：分子水平上的檢測(cè)：①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)；個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）根據(jù)題干信息分析可知， TaNHX2基因?yàn)镹a+/K+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，說(shuō)明TaNHX2基因能控制生物的耐鹽性狀，因此應(yīng)該使用高鹽濃度的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，能生存的菌株即含TaNHX2基因的菌株。PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因的前提條件是有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物。根據(jù)題意和圖示分析，Klenow酶可以將DNA的單鏈區(qū)補(bǔ)平，獲得雙鏈DNA，說(shuō)明Klenow酶是一種DNA聚合酶。

（2）根據(jù)圖2分析，BamHⅠ酶和Sau3AⅠ酶切割后漏出來(lái)的粘性末端相同，可以互補(bǔ)配對(duì)，因此構(gòu)建基因表達(dá)載體的時(shí)候，經(jīng)BamHⅠ酶切割得到的目的基因可以與圖3所示質(zhì)粒被BamHⅠ和Sau3AⅠ兩種酶切后的產(chǎn)物連接。若質(zhì)粒被Sau3AⅠ酶切割后與目的基因相連，則產(chǎn)生的堿基序列不同于BamHⅠ酶的識(shí)別序列，因此連接后的重組質(zhì)粒不一定能被BamHⅠ切割。

（3）采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞時(shí)，先要將目的基因插入農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T-DNA中，然后用該農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞，通過(guò)DNA重組將目的基因插入植物細(xì)胞的染色體DNA上，使目的基因的遺傳特性得以穩(wěn)定維持和表達(dá)。