Question

【題目】Ⅰ．回答下列制作澄清果汁的相關(guān)問題：

（1）殼聚糖本身是一種多孔網(wǎng)狀天然高分子顆粒材料，對(duì)蛋白質(zhì)有顯著的親合力，可將果膠酶通過吸附-交聯(lián)法固定在殼聚糖載體上，再將固定化酶的載體裝到反應(yīng)柱中（見下圖）。固定化酶的好處有________________________、________________________；但固定化酶的活性與未固定前相比較，其活性可能不變，也可能會(huì)發(fā)生________________________。

（2）殼聚糖一般先進(jìn)行________________________處理，然后再與果膠酶混合，使其能固定化更多的果膠酶。固定化酶柱應(yīng)先倒入一定量的蒸餾水，洗掉________________________，然后再倒入渾濁的果汁。

（3）果膠是植物細(xì)胞壁以及________________________的主要組成成分，渾濁的果汁在反應(yīng)柱中從上部流到下部的過程中果膠最終被徹底水解成可溶性的________________________，從而使流出的果汁變的澄清。若以透光率作為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，可變因素是渾濁果汁從上部流到下部的時(shí)間，則實(shí)驗(yàn)結(jié)果最可能為________________________。

Ⅱ．抗生素濫用導(dǎo)致耐藥性目前已成為一個(gè)嚴(yán)重的公共健康問題，近年來，“超級(jí)細(xì)菌”等事件的發(fā)生更顯示出這一問題的嚴(yán)重性�？咕�肽（AMPs）是一類具有廣譜抗菌性，而且其不易產(chǎn)生耐藥性。為了改善抗菌肽的抗菌功能，常利用基因工程技術(shù)使抗菌肽在不同來源的宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行蛋白的重組表達(dá)。β-防御素是一種抗菌肽。構(gòu)建β-防御素（β-defensin130）表達(dá)載體在大腸桿菌中表達(dá)。結(jié)合已知條件回答下列問題：

如圖為表達(dá)載體（PET-28a）和含有目的基因β-防御素（defensin130）的片段。（說明：Kanr和Ampr分別表示卡那霉素和氨芐青霉素抗性基因；promoter表示基因的啟動(dòng)部位）

（1）獲得含有目的基因的重組DNA分子，需用________________________和________________________兩種酶分別切割表達(dá)載體和含有目的基因的片段，并用________________________酶將它們連接。

（2）把構(gòu)建好的重組DNA分子導(dǎo)入到受體細(xì)胞，用適宜濃度的氯化鈣處理受體細(xì)胞增加細(xì)胞壁的通透性的目的是________________________。3×β-defensin130

（3）篩選含有目的基因β-防御素（β-defensin130）的受體細(xì)胞，先將菌液涂布在含有________________________（抗生素）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后將所有菌落轉(zhuǎn)移至含有________________________（抗生素）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，最后挑選出目的菌落。

（4）在無菌操作下將目的單菌落用接種環(huán)取出，再用劃線法接種在斜面培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)24小時(shí)后，置于________________________中保存。

（5）若受體細(xì)胞為雙子葉植物，常用________________________法將目的基因?qū)�入植物體細(xì)胞，再將體細(xì)胞進(jìn)行組織培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)基因植物。

Answer 1

【答案】酶的穩(wěn)定性好（酶可以反復(fù)利用） 酶與底物和產(chǎn)物易分開 下降或上升 研磨 未吸附的果膠酶 胞間（質(zhì)）層 半乳糖醛酸 果汁透光率先變大，然后穩(wěn)定不變 EcoRI XhoI DNA連接酶 增加轉(zhuǎn)化的成功率 Kan Amp 4°C冰箱 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

【解析】

Ⅰ．本題主要考查固化酶和果膠酶的相關(guān)知識(shí)。果膠物質(zhì)主要存在于植物初生壁和細(xì)胞中間，果膠物質(zhì)是細(xì)胞壁的基質(zhì)多糖。果膠酶本質(zhì)上是聚半乳糖醛酸水解酶，果膠酶水解果膠主要生成β-半乳糖醛酸。

Ⅱ．本題考基因工程的應(yīng)用和菌種的保存，意在考查考生的識(shí)圖能力和對(duì)所學(xué)知識(shí)的理解能力。

Ⅰ．（1）固定化酶的優(yōu)點(diǎn)有：不溶于水，易于與底物、產(chǎn)物分離；穩(wěn)定性好；可反復(fù)使用；可連續(xù)化生產(chǎn)，但固定化酶的活性與未固定時(shí)相比較，其活性可能不變，也可能由于固定介質(zhì)的影響而發(fā)生下降或上升的變化。
（2）固定化酶過程中，殼聚糖一般先進(jìn)行研磨，提高殼聚糖表面粗糙度處理以增大固定化酶的接觸面積，然后再與果膠酶混合，以固定化更多的果膠酶。固定化酶柱應(yīng)先倒入一定量的蒸餾水洗掉未被固定的酶等，然后再倒入渾濁的果汁。
（3）果膠是植物細(xì)胞壁以及胞間層的主要組成成分之一。果膠酶能使榨取果汁更容易，也使得渾濁的果汁變得澄清。渾濁的果汁在反應(yīng)柱中從上部流到下部的過程中果膠被分解成可溶性的半乳糖醛酸，從而使流出來的果汁變得澄清。若以透光率作為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，可變因素是渾濁果汁從上部流到下部的時(shí)間，則實(shí)驗(yàn)結(jié)果最可能為半乳糖醛酸果汁透光率先變大，然后穩(wěn)定不變。

Ⅱ．（1）根據(jù)圖示中目的基因兩端限制酶的酶切位點(diǎn)以及質(zhì)粒上限制酶的酶切位點(diǎn)可知獲得含有目的基因的重組DNA分子，需用EcoRI和XhoI兩種酶分別切割表達(dá)載體和含有目的基因的片段，以保證載體和目的基因能形成相同的黏性末端，并用DNA連接酶將它們連接。

（2）把構(gòu)建好的重組DNA分子導(dǎo)入到受體細(xì)胞，用適宜濃度的氯化鈣處理受體細(xì)胞增加細(xì)胞壁的通透性，目的是使受體細(xì)胞成為感受態(tài)，使表達(dá)載體容易進(jìn)入受體細(xì)胞，以增加轉(zhuǎn)化的成功率。

（3）篩選含有目的基因β-防御素（β-defensin130）的受體細(xì)胞，先將菌液涂布在含有Kan的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后將所有菌轉(zhuǎn)移至含有Amp的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，最后挑選出目的菌落。

（4）菌種的臨時(shí)保藏需在無菌操作下將目的單菌落用接種環(huán)取出，再用劃線法接種在斜面上，37°C培養(yǎng)24小時(shí)后，置于4℃冰箱中保存。

（5）農(nóng)桿菌在自然條件下可感染雙子葉植物和裸子植物，所以若受體細(xì)胞為雙子葉植物，常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)�入植物體細(xì)胞，再將體細(xì)胞進(jìn)行組織培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)基因植物。