Question

【題目】新型冠狀病毒是一種單鏈 RNA 病毒，新型冠狀病毒感染的常規(guī)檢測(cè)方法是通過實(shí)時(shí)熒光 PCR 鑒定。

（1）首先，從樣本中提取病毒RNA，經(jīng)_____酶作用生成cDNA。然后以cDNA為模板 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，測(cè)定樣品中病毒核酸量。

（2）通過實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增目的基因，需額外添加熒光標(biāo)記探針（一小段單鏈DNA，可與目的基因中部序列特異性結(jié)合）。當(dāng)探針完整時(shí)，不產(chǎn)生熒光。在PCR過程中，與目的基因結(jié)合的探針被TaqDNA聚合酶水解，R與Q分離后，R發(fā)出的熒光可被檢測(cè)到（如圖 1）。

① 當(dāng)樣本中有目的基因時(shí)，引物和探針與目的基因退火，通過形成_____而特異性結(jié)合。

② 在 PCR 循環(huán)的_____階段，TaqDNA 聚合酶催化子鏈的合成并水解探針。檢測(cè)到的熒光強(qiáng)

（3）在通過實(shí)時(shí)熒光 PCR 檢測(cè)新型冠狀病毒感染時(shí)，檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度變化如圖 2 所示。

① 與指數(shù)增長(zhǎng)期相比，線性增長(zhǎng)期目的基因數(shù)量的增長(zhǎng)率下降，原因有_____。

② Ct 值的含義：在 PCR 擴(kuò)增過程中，每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的熒光閾值時(shí)所經(jīng)歷的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。因此，當(dāng)樣本中初始模板越多時(shí)，Ct 值就_____。

③ 某新型冠狀病毒核酸檢測(cè)說明書標(biāo)明，Ct≤37 判定為陽性，Ct>40 或無 Ct 值判定為陰性。圖 2 所示新型冠狀病毒核酸檢測(cè)結(jié)果應(yīng)判定為_____。

（4）陰性結(jié)果也不能排除新型冠狀病毒感染�？赡墚a(chǎn)生假陰性的因素有_____。

a．取樣太早，樣本中病毒量少，達(dá)不到實(shí)時(shí)熒光 PCR 檢測(cè)閾值

b．樣本被污染，RNA酶將病毒RNA降解

c．病毒發(fā)生變異

Answer 1

【答案】逆轉(zhuǎn)錄 氫鍵 延伸 底物濃度下降、酶活性下降 越小 陽性 abc

【解析】

PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可分為變性、復(fù)性、延伸三步，常需要進(jìn)行一次預(yù)變性，以便增加大分子模板DNA徹底變性的概率。

（1）由病毒RNA生成cDNA的過程屬于逆轉(zhuǎn)錄，需要逆轉(zhuǎn)錄酶的催化。

（2）① 當(dāng)樣本中有目的基因時(shí)，引物和探針與目的基因退火，通過堿基互補(bǔ)配對(duì)形成氫鍵而特異性結(jié)合。②在 PCR 循環(huán)的延伸階段，TaqDNA 聚合酶催化子鏈的合成并水解探針。

（3）① 線性增長(zhǎng)期目的基因數(shù)量的增長(zhǎng)率下降，有可能是底物濃度降低導(dǎo)致的，也有可能是酶的活性緩慢下降導(dǎo)致的。② 樣本中初始模板越多時(shí)，達(dá)到設(shè)定的熒光閾值時(shí)所經(jīng)歷的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)就越小，Ct 值就越低。③ 據(jù)圖2可知熒光閾值大概是36，新型冠狀病毒核酸檢測(cè)結(jié)果應(yīng)判定為陽性。

（4）陰性結(jié)果也不能排除新型冠狀病毒感染�？赡墚a(chǎn)生假陰性的因素有，取樣太早，樣本中病毒量少，達(dá)不到實(shí)時(shí)熒光 PCR 檢測(cè)閾值，樣本被污染，RNA酶將病毒RNA降解，病毒發(fā)生變異。