Question

19．圖1為某種質(zhì)粒表達(dá)載體簡(jiǎn)圖，小箭頭所指分別為限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI、BamHI的酶切位點(diǎn)，amp^R為青霉素抗性基因，tct^R為四環(huán)素抗性基因，P為啟動(dòng)因子，T為終止子，ori為復(fù)制原點(diǎn)．已知目的基因的兩端分別有包括EcoRI、BamHI在內(nèi)的多種酶的酶切位點(diǎn)．
（1）將含有目的基因的DNA與質(zhì)粒表達(dá)載體分別用EcoRI酶切，酶切產(chǎn)物用DNA連接酶進(jìn)行連接后，其中由兩個(gè)DNA片段之間連接形成的產(chǎn)物有目的基因-載體連接物、載體-載體連接物、目的基因-目的基因連接物三種．若要從這些連接產(chǎn)物中分離出重組質(zhì)粒，需要對(duì)這些連接產(chǎn)物進(jìn)行分離純化．
（2）用上述3種連接產(chǎn)物與無(wú)任何抗藥性的原核宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)．之后將這些宿主細(xì)胞接種到含四環(huán)素的培養(yǎng)基中，能生長(zhǎng)的原核宿主細(xì)胞所含有的連接產(chǎn)物是載體-載體連接物；若接種到含青霉素的培養(yǎng)基中，能生長(zhǎng)的原核宿主細(xì)胞所含有的連接產(chǎn)物是目的基因-載體連接物．
（3）目的基因表達(dá)時(shí)，RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)是啟動(dòng)子，其合成的產(chǎn)物是RNA．
（4）在上述實(shí)驗(yàn)中，為了防止目的基因和質(zhì)粒表達(dá)載體在酶切后產(chǎn)生的末端發(fā)生任意連接，酶切時(shí)應(yīng)選用的酶是EcoRⅠ和BamHⅠ．
（5）請(qǐng)?jiān)趫D2中畫(huà)出某DNA片段被切割形成黏性末端的過(guò)程示意圖．
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Answer 1

分析 用上述兩種限制酶同時(shí)切割目的基因后，目的基因的兩個(gè)黏性末端不同，這樣目的基因就不會(huì)自連成環(huán)狀．同樣用上述兩種限制酶同時(shí)切割質(zhì)粒后，質(zhì)粒的兩個(gè)黏性末端也不同，這樣質(zhì)粒也不會(huì)自連．這樣當(dāng)把切割后目的基因和切割后質(zhì)粒混合后，只有目的基因和質(zhì)粒才能相連．產(chǎn)物中只有重組質(zhì)粒，而無(wú)其他的連接產(chǎn)物．

解答 解：（1）由于含有目的基因的DNA片段和質(zhì)粒上均含有EcoRI酶的切割位點(diǎn)，所以用此酶切割后產(chǎn)生相同的黏性末端．這樣，具有相同黏性末端的片段用DNA連接酶均可連接，從而產(chǎn)生3種連接產(chǎn)物，目的基因-載體連接物、載體-載體連接物、目的基因-目的基因連接物，所以要進(jìn)行分離純化．
（2）由于將細(xì)胞放入含四環(huán)素的培養(yǎng)基，要將存活tct^R 為四環(huán)素抗性基因結(jié)構(gòu)要保持完整，用EcoRI酶切后再用連接酶連接的三種產(chǎn)物只有載體-載體連接物基因結(jié)構(gòu)保持完整；若接種到含青霉素的培養(yǎng)基中，能生長(zhǎng)的原核宿主細(xì)胞所含有的連接產(chǎn)物是目的基因-載體連接物．
（3）目的基因表達(dá)時(shí)，RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)是啟動(dòng)子，其合成的產(chǎn)物是RNA．
（4）防止目的基因和基因和質(zhì)粒表達(dá)載體在酶切后產(chǎn)生的末端發(fā)生任意連接，需要有兩種限制酶，而amp^R為青霉素抗性基因，P啟動(dòng)子，T為終止子，ori為復(fù)制原點(diǎn)，結(jié)構(gòu)不能被破壞，故選擇EcoRⅠ和BamHⅠ這兩種限制酶．
（5）DNA片段被切割形成黏性末端的過(guò)程示意圖為：
故答案為：
（1）目的基因-載體連接物      載體-載體連接物      目的基因-目的基因連接物      分離純化  
（2）載體-載體連接物  目的基因-載體連接物
（3）啟動(dòng)子              RNA
（4）EcoRⅠ和BamHⅠ
（5）

點(diǎn)評(píng) 本題考查基因工程的相關(guān)知識(shí)，意在考查考生能運(yùn)用所學(xué)知識(shí)與觀點(diǎn)，通過(guò)比較、分析與綜合等方法對(duì)某些生物學(xué)問(wèn)題進(jìn)行解釋、推理，做出合理的判斷或的能力．學(xué)生基因工程工具原理的應(yīng)用理解不到位，特別是2種工具酶與獲取目的基因和表達(dá)載體之間的聯(lián)系與拓展．