Question

【題目】雞干擾素是一種具有高效和廣譜抗病毒作用的細胞因子，廣泛用于動物領域的抗病毒治療。科研人員將雞干擾素基因作為目的基因，構建基因表達載體，通過農(nóng)桿菌介導法導入煙草，以獲得抗病毒煙草。下圖為科研人員制備能合成雞干擾素的煙草愈傷組織細胞的流程，①～④表示相關的操作，兩種限制酶的識別序列及切割位點如表所示。請回答下列問題：

（1）步驟①中，利用PCR技術擴增干擾素基因時，設計引物序列的主要依據(jù)是__________�？蒲腥藛T還在兩種引物的一端分別加上了__________和__________序列，以便于后續(xù)的剪切和連接，一個DNA分子三輪復制以后，含有兩種引物的DNA分子有__________個。為防止酶切產(chǎn)物自身環(huán)化，構建表達載體需用兩種限制酶，選擇的原則是__________。

A. Ti質粒內，每種限制酶只有一個切割位點

B. 目的基因編碼蛋白質的序列中，每種限制酶只有一個切割位點

C. 酶切后，目的基因形成的兩個黏性末端序列不相同

D. 酶切后，Ti質粒形成的兩個黏性末端序列相同

（2）步驟②所構建的基因表達載體中未標注出的必需元件還有__________，步驟③中需先用__________處理農(nóng)桿菌以便將基因表達載體導入細胞。

（3）步驟④中，科研人員提取愈傷組織細胞的RNA后，先通過__________獲得DNA，再進行PCR擴增，若最終未能檢測出干擾素基因，其可能原因是__________。

Answer 1

【答案】雞干擾素基因兩端的部分核苷酸序列 GAATTC GGATCC 6 AC 復制原點 Ca2+ 逆轉錄 雞干擾素基因未能導入煙草愈傷組織細胞或導入煙草愈傷組織細胞的雞干擾素基因未能轉錄

【解析】

分析題圖：過程①表示目的基因的獲取，過程②表示基因表達載體的構建，過程③表示將基因表達載體導入農(nóng)桿菌中，過程④表示目的基因的檢測和鑒定。

（1）干擾素基因屬于目的基因。步驟①中，利用PCR技術擴增干擾素基因時，設計引物序列的主要依據(jù)是雞干擾素基因兩端的部分核苷酸序列。分析題圖可知，該過程用EcoRI和BamHI兩種限制酶分別切割目的基因和質粒，所以科研人員還在兩種引物的一端分別加上了GAATTC和GGATCC序列，以便于后續(xù)的剪切和連接。PCR技術的原理是DNA雙鏈復制的原理，據(jù)此并結合利用PCR技術擴增目的基因的過程可推知：一個DNA分子三輪復制以后，含有兩種引物的DNA分子有6個。為防止酶切產(chǎn)物自身環(huán)化，構建表達載體需用兩種限制酶，選擇的原則是：Ti質粒內，每種限制酶有1個切割位點；酶切后，目的基因形成的兩個黏性末端序列不相同。

（2）基因表達載體中除含有啟動子、終止子、標記基因和目的基因外，還應有復制原點，以便使導入的目的基因能夠在宿主細胞中復制，所以步驟②所構建的基因表達載體中未標注出的必需元件還有復制原點。步驟③中需先用Ca2+處理農(nóng)桿菌，使其成為感受態(tài)細胞，以便將基因表達載體導入細胞。

（3）步驟④中，科研人員提取愈傷組織細胞的RNA后，先通過逆轉錄獲得DNA，再進行PCR擴增。若最終未能檢測出干擾素基因，其可能原因是雞干擾素基因未能導入煙草愈傷組織細胞或導入煙草愈傷組織細胞的雞干擾素基因未能轉錄。