Question

【題目】回答下列（一）、（二）小題：

（一）日常生活中所使用的生物產(chǎn)品，都是由多種酶經(jīng)過一系列生化反應(yīng)的產(chǎn)物。例如用糯米釀酒，就是使用微生物在一定條件下，經(jīng)過一系列酶促反應(yīng)獲得產(chǎn)物的結(jié)果。

（1）首先，糯米中的淀粉在_______的條件下水解成糖，這一過程是由酒曲中的__________產(chǎn)生 的淀粉酶完成的，于是發(fā)酵料變甜。然后，在_______________條件下酵母菌經(jīng)過糖酵解和乙醇發(fā)酵反應(yīng)，產(chǎn)生乙醇。

（2）為獲得純凈酵母菌，常常需要用劃線分離法獲得單菌落。在第二次及以后劃線時，總 是從上一次的末端開始劃線，這樣做的目的是__________________ 。劃線的某個平板培養(yǎng) 后，第一劃線區(qū)域的劃線上都不間斷的長滿了菌落，第二劃線區(qū)域的第一條線上無菌落，其他劃線上有菌落，造成劃線無菌落可能的操作失誤有________________（至少答兩點）。

（3）可用固定化酵母細(xì)胞進(jìn)行酒精發(fā)酵。該操作中需使用海藻酸鈉，其作用是____________。 選擇固定化酵母細(xì)胞而不是固定化酶進(jìn)行酒精發(fā)酵的主要原因是________________。

（二）請回答與基因工程有關(guān)問題：

（1）基因工程基本操作步驟，一般包括：目的基因的獲取→酶切→連接→_______ →篩選→檢測基因的表達(dá)。其中第一步中，可用_______擴(kuò)增的方式獲得大量基因；第二步中為防止DNA的自連，我們常使用___________的方式進(jìn)行酶切；第三步連接反應(yīng)時為提高連接效率，需注意外源目的基因與質(zhì)粒比例；第四步將重組DNA 導(dǎo)入受體細(xì)胞前，常使用Ca2+處理大腸桿菌，使之成為____________細(xì)胞；第五步篩選含有目的基因的受體細(xì)胞，常會 借助載體上____________的表達(dá)；第六步檢測目的基因是否翻譯成了病毒蛋白質(zhì)，利用的 技術(shù)是________。

（2）包涵體，是外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)時，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白質(zhì)顆粒，無生物學(xué)活性。包涵體形成與胞質(zhì)內(nèi)蛋白質(zhì)生成速率有關(guān)，短時間內(nèi)新生成的多肽濃度過高，無充足的時間進(jìn)行折疊，易形成包涵體，另外，宿主菌的培養(yǎng)條件，如培養(yǎng)基成分、pH值、離子強(qiáng)度等因素也與此有關(guān)。對此我們可以采取的措施是___________，誘導(dǎo)培養(yǎng)時對搖床進(jìn)行 處理。在下游工藝純化蛋白時，細(xì)菌裂解液的澄清工藝很重要，因為裂解液中顆粒物進(jìn)入層析柱的柱床中填料間隙，會導(dǎo)致層析柱使用時反壓升高，從而導(dǎo)致流速___________，影響整個工藝效率。

Answer 1

【答案】有氧和溫度較高 黑根霉或黑曲霉 較低溫度和無氧 劃線末端的菌液較少，從這里開始劃線更有利于加大細(xì)菌間的距離，獲得單菌落 接種環(huán)灼燒后未冷卻、第二次劃線未從第一次劃線末端開始 作為載體利用包埋法固定酵母細(xì)胞 酒精發(fā)酵需要多種酶的參與，固定化酵母細(xì)胞中含有多種酶，實現(xiàn)連續(xù)發(fā)酵、連續(xù)生產(chǎn)的目的 轉(zhuǎn)化 PCR 雙酶切 感受態(tài) 標(biāo)記基因 抗原抗體雜交 降溫降速 減慢

【解析】

1、固定化細(xì)胞優(yōu)點：成本更低，操作更容易，可以催化一系列的化學(xué)反應(yīng)。缺點：反應(yīng)物不易與酶接近，尤其是大分子物質(zhì)，反應(yīng)效率下降。

2、基因工程技術(shù)的基本步驟：

（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。

（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動子、終止子和標(biāo)記基因等。

（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入動物�?xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因—DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA—分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)—抗原-抗體雜交技術(shù)。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（一）（1）首先，糯米中的淀粉在有氧和溫度較高的條件下水解成糖，這一過程是由酒曲中的黑根霉或黑曲霉產(chǎn)生的淀粉酶完成的，于是發(fā)酵料變甜。然后，在較低溫度和無氧條件下酵母菌經(jīng)過糖酵解和乙醇發(fā)酵反應(yīng)，產(chǎn)生乙醇。

（2）由于劃線末端的菌液較少，從這里開始劃線更有利于加大細(xì)菌間的距離，獲得單菌落，所以在第二次及以后劃線時，總是從上一次的末端開始劃線。劃線的某個平板培養(yǎng)后，第一劃線區(qū)域的劃線上都不間斷的長滿了菌落，第二劃線區(qū)域的第一條線上無菌落，其他劃線上有菌落，造成劃線無菌落可能的操作失誤有接種環(huán)灼燒后未冷卻，菌種被燙死了，或者是第二次劃線未從第一次劃線末端開始。

（3）固定化酵母細(xì)胞時海藻酸鈉的作用是作為載體，利用包埋法固定酵母細(xì)胞。酒精發(fā)酵過程需要多種酶參與，固定細(xì)胞就是固定細(xì)胞內(nèi)的一系列酶，可達(dá)到連續(xù)生產(chǎn)的目的，而固定化酶只能固定一種或一類酶，只能催化一種化學(xué)反應(yīng)，所以選擇固定化酵母細(xì)胞而不是固定化相關(guān)酶進(jìn)行酒精發(fā)酵。

（二）（1）基因工程基本操作步驟，一般包括：目的基因的獲取→酶切→連接→轉(zhuǎn)化→篩選→檢測基因的表達(dá)。其中獲取大量目的基因可用PCR技術(shù)擴(kuò)增。構(gòu)建基因表達(dá)載體時，為防止DNA的自連，常使用雙酶切的方式進(jìn)行酶切；第四步將重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞前，常使用Ca2+處理大腸桿菌，使之成為感受態(tài)細(xì)胞，易于吸收周圍環(huán)境中的DNA。第五步篩選含有目的基因的受體細(xì)胞，常會借助載體上標(biāo)記基因的表達(dá)；第六步檢測目的基因是否翻譯成了病毒蛋白質(zhì)，利用的技術(shù)是抗原-抗體雜交。

（2）包涵體形成與胞質(zhì)內(nèi)蛋白質(zhì)生成速率有關(guān)，短時間內(nèi)新生成的多肽濃度過高，無充足的時間進(jìn)行折疊，易形成包涵體，另外，宿主菌的培養(yǎng)條件，如培養(yǎng)基成分、pH值、離子強(qiáng)度等因素也與此有關(guān)。對此我們可以降溫降速，降低蛋白質(zhì)的合成速率。裂解液中顆粒物進(jìn)入層析柱的柱床中填料間隙，會導(dǎo)致層析柱使用時反壓升高，從而導(dǎo)致流速減慢，影響整個工藝效率。