Question

【題目】為研究肝癌致病機理，科研工作者利用下圖所示的差異雜交法和基因工程獲取相關癌基因以作進一步研究。請據圖回答問題：

（1）圖 1 中，A 過程需要用___________ 酶，D 過程需要回收___________ （填“未雜交”或“雜交分子”）的含 32P 的 cDNA 單鏈，繼而通過人工合成，獲得___________， 并用其構建基因文庫。

（2）分子生物學檢測是基因工程成功與否的重要一環(huán)，其中檢測目的基因是否發(fā)揮功能作用的第一 步是檢測_________________________ ，若檢測目的基因是否成功表達，則需用_______________ 方 法，該方法的原理是_____________________。

（3）上圖 2 為改造后的目的基因。圖 3 為兩種質粒，其中 Ampr 為氨芐青霉素抗性基因，Tetr 為四環(huán)素抗性基因，lacZ 為藍色顯色基因，其表達產物可使底物 X-Gal 呈藍色。EcoRⅠ（0.7Kb）、NotⅠ（1.2Kb）等為限制酶及其切割位點與復制原點之間的距離（1kb=1000 個堿基對）。

①圖 3 中能作為載體的最理想的質粒是___________（填“X”或“Y”），用選定的質粒與圖 2 的目的基因構建基因表達載體時，應選用的限制酶是___________。

②若用 EcoRⅠ完全酶切上述①中獲得的重組質粒，并進行電泳觀察，可出現(xiàn)四種長度不同的片段，其長度分別為 1.7kb、5.3kb、______________________。

Answer 1

【答案】逆轉錄酶 未雜交 雙鏈cDNA 目的基因是否轉錄出mRNA 抗原-抗體雜交 抗原與抗體的特異性結合 X NotⅠ 3.1kb和3.9kb

【解析】

1、基因工程技術的基本步驟：

（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成。

（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。

（3）將目的基因導入受體細胞：根據受體細胞不同，導入的方法也不一樣．將目的基因導入植物細胞的方法有農桿菌轉化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因導入微生物細胞的方法是感受態(tài)細胞法。

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質--抗原-抗體雜交技術。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）據圖可知圖1為構建基因文庫的過程，其中需要單鏈mRNA通過A過程形成雜交雙鏈分子，需要逆轉錄酶，D過程需要回收未雜交的含 32P 的 cDNA 單鏈，繼而通過人工合成，獲得雙鏈cDNA，并用其構建基因文庫。

（2）其中檢測目的基因是否發(fā)揮功能作用的第一步是檢測目的基因是否轉錄出mRNA ，若檢測目的基因是否成功表達（是否合成相關蛋白質），則需用抗原-抗體雜交方法，該方法的原理是抗原與抗體的特異性結合。

（3）質粒X既有四環(huán)素抗性基因Tetr ，藍色顯色基因lacZ ，便于對目的基因進行監(jiān)測和篩選。因此能做為載體的最理想的質粒是X，NotⅠ的切割位點位于目的基因兩側，不會破壞目的基因，而EcoRⅠ的切割位點位于基因中間，會破壞目的基因，因此用選定的質粒與圖 2 的目的基因構建基因表達載體時，應選用的限制酶是NotⅠ。若用 EcoRⅠ完全酶切上述①中獲得的重組質粒，并進行電泳觀察，可出現(xiàn)四種長度不同的片段，分析重組質粒，合并重復長度可知其長度分別為 1.7kb、5.3kb、3.1kb和3.9kb。