Question

下面是將乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白的基因HBsAg導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母菌生產(chǎn)乙肝疫苗的過程及有關(guān)資料，請分析回答下列問題．

資料1：巴斯德畢赤酵母菌是一種甲基營養(yǎng)型酵母菌，能將甲醇作為其唯一碳源，同時(shí)AOX1基因能受甲醇誘導(dǎo)而表達(dá)【5′AOX1和3′AOX1（TT）分別是基因AOX1的啟動(dòng)子和終止子】．
資料2：巴斯德畢赤酵母菌體內(nèi)無天然質(zhì)粒，所以科學(xué)家改造出了圖1所示的pPIC9K質(zhì)粒用作載體，其與目的基因形成的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后可以與酵母菌染色體發(fā)生同源重組，將目的基因整合于染色體中以實(shí)現(xiàn)表達(dá)．
（1）如果要將HBsAg基因和pPIC9K質(zhì)粒重組，應(yīng)該在HBsAg基因兩側(cè)的A和B位置接上

 

、

 

限制酶識別序列，這樣設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)是

 

．
（2）酶切獲取HBsAg基因后，需用

 

將其連接到pPIC9K質(zhì)粒上，形成重組質(zhì)粒，并將其導(dǎo)入大腸桿菌以獲取

 

．
（3）步驟3中應(yīng)選用限制酶

 

來切割重組質(zhì)粒獲得重組DNA，然后將其導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母菌細(xì)胞．
（4）為了確認(rèn)巴斯德畢赤酵母菌轉(zhuǎn)化是否成功，在培養(yǎng)基中應(yīng)該加入

 

以便篩選，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞中是否含有HBsAg基因，可以用分子雜交方法進(jìn)行檢測．
（5）轉(zhuǎn)化的酵母菌在培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時(shí)間后，需要向其中加入

 

以維持其生活，同時(shí)誘導(dǎo)HBsAg基因表達(dá)．
（6）與大腸桿菌等細(xì)菌相比，用巴斯德畢赤酵母菌細(xì)胞作為基因工程的受體細(xì)胞，其優(yōu)點(diǎn)是在蛋白質(zhì)合成后，細(xì)胞可以對其進(jìn)行

 

并分泌到細(xì)胞外，便于提取．
（7）若某種限制酶切割DNA分子后形成的粘性末端為則該酶識別的核苷酸序列是

 

．

Answer 1

考點(diǎn)：基因工程的應(yīng)用

專題：

分析：分析題圖：圖中質(zhì)粒含有SnaB、AvrⅡ、BglⅡ和SacI限制酶切割位點(diǎn)，其中SacI位于啟動(dòng)子上，BglⅡ位于終止子上．要將HBsAg基因和pPIC9K質(zhì)粒重組，只能用限制酶SnaB和AvrⅡ切割質(zhì)粒，要獲取含有5′AOX1--3′AOX1段基因，應(yīng)選用限制酶BglⅡ來切割．5′AOX1--3′AOX1段基因含有卡那霉素抗性基因，在培養(yǎng)基中加入卡那霉素以便篩選導(dǎo)入重組質(zhì)粒的目的菌．

解答： 解：（1）圖中質(zhì)粒含有SnaB、AvrⅡ、BglⅡ和SacI限制酶切割位點(diǎn)，其中SacI位于啟動(dòng)子上，BglⅡ位于終止子上．如果要將HBsAg基因和pPIC9K質(zhì)粒重組，只能用限制酶SnaB和AvrⅡ切割質(zhì)粒，所以應(yīng)在HBsAg基因兩側(cè)的A和B位置接上SnaB、AvrⅡ限制酶識別序列．這兩種酶切割產(chǎn)生的黏性末端不同，這樣可以避免質(zhì)粒和目的基因自身環(huán)化，還可以防止目的基因和質(zhì)粒反向連接．
（2）獲取目的基因后，需要用DNA連接酶將目的基因和運(yùn)載體連接形成重組質(zhì)粒，并將其導(dǎo)入大腸桿菌以獲取大量重組質(zhì)粒．
（3）步驟3是要獲取含有5′AOX1--3′AOX1段基因，應(yīng)選用限制酶BglⅡ來切割重組質(zhì)粒獲得重組DNA，然后將其導(dǎo)入巴斯德畢赤酵母菌細(xì)胞．
（4）5′AOX1--3′AOX1段基因含有卡那霉素抗性基因，則導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌能抗卡那霉素，所以為了確認(rèn)巴斯德畢赤酵母菌轉(zhuǎn)化是否成功，在培養(yǎng)基中應(yīng)該加入卡那霉素以便篩選．轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞中是否含有HBsAg基因，可以用DNA分子雜交方法進(jìn)行檢測．
（5）巴斯德畢赤酵母菌是一種甲基營養(yǎng)型酵母菌，能將甲醇作為其唯一碳源，同時(shí)甲醇能誘導(dǎo)AOX1基因表達(dá)．所以轉(zhuǎn)化的酵母菌在培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時(shí)間后，需要向其中加入甲醇以維持其生活，同時(shí)誘導(dǎo)HBsAg基因表達(dá)．
（6）細(xì)菌是原核生物，只含核糖體一種細(xì)胞器，而酵母菌是真核生物，除含有核糖體外，還含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細(xì)胞器．所以與細(xì)菌相比，用巴斯德畢赤酵母菌細(xì)胞作為基因工程的受體細(xì)胞，其優(yōu)點(diǎn)是在蛋白質(zhì)合成后，細(xì)胞可以對其進(jìn)行加工（修飾）并分泌到細(xì)胞外，便于提�。�
（7）限制酶識別的序列一般是回文系列，若某種限制酶切割DNA分子后形成的粘性末端為，則該酶識別的核苷酸序列是GACGTC．
故答案：（1）SnaB   AvrⅡ避免質(zhì)粒和目的基因自身環(huán)化；
（2）DNA連接酶     大量重組質(zhì)粒
（3）BglⅡ
（4）卡拉霉素
（5）甲醇
（6）加工（修飾）
（7）GACGTC

點(diǎn)評：本題結(jié)合工程菌形成過程，考查基因工程的相關(guān)知識，意在考查考生分析題圖獲取有效信息的能力；理解所學(xué)知識要點(diǎn)，把握知識間聯(lián)系的能力；能運(yùn)用所學(xué)知識解決生物學(xué)問題的能力和應(yīng)用能力．