Question

【題目】回答下列（一）、（二）小題：

（一）平板澆注法是常用的菌種分離純化方法，是將待分離的樣品用無菌水作梯度系列稀釋后，取合適稀釋度的少量菌懸液加至無菌培養(yǎng)皿中，立即倒入融化的固體培養(yǎng)基，經(jīng)充分混勻后，置室溫下培養(yǎng)。下圖是研究人員用平板澆注法從土壤樣品中分離以工業(yè)廢甲醇為碳源的酵母菌，并進行大量培養(yǎng)的操作流程，請回答下列問題：

（1）為分離培養(yǎng)該酵母菌，配制培養(yǎng)基時應以___________為唯一碳源，按照培養(yǎng)基配方準確稱量各組分，將其溶解、定容后，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH，及時對培養(yǎng)基進行分裝，并進行_____________滅菌。

（2）取步驟②中不同梯度的稀釋液加入標記好的無菌培養(yǎng)皿中，在步驟③中將溫度約__________（在25℃、50℃或80℃（3個中選擇）的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿混勻，冷凝后倒置培養(yǎng)。經(jīng)培養(yǎng)，可在培養(yǎng)基的 _____________部位出現(xiàn)許多單菌落。

（3）挑取平板中長出的單菌落，按步驟④所示進行劃線分離。下列敘述不合理的是_______。

A．為保證無菌操作，接種環(huán)使用前必須進行灼燒滅菌

B．劃線時應避免劃破培養(yǎng)基表面，以免不能形成正常菌落

C．挑取菌落時，應挑取多個菌落，分別測定酵母細胞中甲醇的含量

D．可以通過逐步提高培養(yǎng)基中甲醇的濃度，獲得甲醇高耐受株

（4）步驟⑤中，為使酵母數(shù)量迅速增加，培養(yǎng)過程中需保證充足的營養(yǎng)和____________供應。為監(jiān)測酵母的細胞密度，將發(fā)酵液稀釋1000倍后，用25×16（2mm×2mm×0．lmm）型血細胞計數(shù)板計數(shù)5個中格中的細胞數(shù)，細胞的個數(shù)應不少于_____________，才能達到每毫升至少含2×109個細胞的預期密度。

（二）回答與基因工程及其應用有關的問題：

（1）博耶（H．Boyer）和科恩（S．Coben）將非洲爪蟾核糖體蛋白基因與質(zhì)粒重組后導入大腸桿菌細胞中進行了表達，該研究除證明了質(zhì)粒可以作為載體外，還證明了_____________________（答出兩點即可）。

（2）體外重組的質(zhì)�？赏ㄟ^Ca2+參與的方法導入大腸桿菌細胞；而體外重組的噬菌體DNA通常需與_________組裝成完整噬菌體后，才能通過侵染的方法將重組的噬菌體DNA導入宿主細胞，在細菌、心肌細胞、葉肉細胞中，可作為重組噬菌體宿主細胞的是___________。

（3）真核生物基因（目的基因）在大腸桿菌細胞內(nèi)表達時，產(chǎn)生出的蛋白質(zhì)可能會被降解。為防止大腸桿菌內(nèi)的蛋白質(zhì)被降解，在實驗中應選用___________的大腸桿菌作為受體細胞。在提取純化蛋白質(zhì)的過程中應添加________，防止目的蛋白質(zhì)被降解。

Answer 1

【答案】甲醇 高壓蒸汽 50℃ 表層和內(nèi)部 C 氧氣 160 體外重組的質(zhì)�？梢赃M入受體細胞；真核生物基因可在原核細胞中表達 外殼蛋白（或答噬菌體蛋白） 細菌 蛋白酶缺陷型 蛋白酶

【解析】

1、稀釋涂布平板法在培養(yǎng)基上分離、培養(yǎng)出微生物的單個菌落，以便于計數(shù)、移植、分離，從而達到純化培養(yǎng)的目的。

2、選擇培養(yǎng)基是在培養(yǎng)基中加入某種化學物質(zhì)，以抑制不需要的微生物的生長，促進所需要的微生物的生長。從土壤樣品中分離以工業(yè)廢甲醇為碳源的酵母菌，那么培養(yǎng)基中要加入甲醇，且是唯一碳源。

3、據(jù)圖分析，①稱量土樣，里面含有需要分離的酵母菌；②表示梯度稀釋，③④表示平板劃線法，進行純化培養(yǎng)；⑤表示擴大培養(yǎng)，獲得更多的酵母菌。

4、基因工程技術(shù)的基本步驟：（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴增和人工合成。（2）基因表達載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。（3）將目的基因?qū)�入受體細胞：根據(jù)受體細胞不同，導入的方法也不一樣。將目的基因?qū)�入植物細胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物細胞的方法是感受態(tài)細胞法。（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因—DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA—分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)—抗原-抗體雜交技術(shù)。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（一）（1）要想從土壤樣品中分離以工業(yè)廢甲醇為碳源的酵母菌，配制培養(yǎng)基時應以甲醇為唯一碳源，按照培養(yǎng)基配方準確稱量各組分，將其溶解、定容后，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH，及時對培養(yǎng)基進行分裝，并進行高壓蒸汽滅菌。

（2）倒平板時，培養(yǎng)基需要冷卻到50℃左右才能用來倒平板，所以在步驟③中應將溫度約50℃的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿混勻，冷凝后倒置培養(yǎng)。由于酵母菌為兼性厭氧型，所以經(jīng)培養(yǎng)，可在培養(yǎng)基的表層和內(nèi)部部位出現(xiàn)單菌落。

（3）A、接種針、接種環(huán)使用前都必須滅菌，做到無菌操作，A正確；

B、劃線時應避免劃破培養(yǎng)基表面，否則大量酵母菌聚集，不能形成正常菌落，B正確；

C、挑取菌落時，應挑取多個菌落，分別測定培養(yǎng)液中甲醇的含量，C錯誤；

D、可以通過逐步提高培養(yǎng)基中甲醇的濃度，獲得甲醇高耐受株，D正確。

故選C。

（4）有氧呼吸能為酵母菌的繁殖提供大量能量，所以步驟⑤中，為使酵母數(shù)量迅速增加，培養(yǎng)過程中需保證充足的營養(yǎng)和氧氣供應，以促進有氧呼吸，進而大量繁殖。假設理論上5個中方格的活細胞數(shù)不應少于n才能達到每毫升2×109個活細胞的預期密度，根據(jù)“將發(fā)酵液稀釋1000倍后，用25×16（2mm×2mm×0．lmm）型血細胞計數(shù)板計數(shù)”，可列式為25÷5×n÷0.4×1000×1000=2×109，解得n=160，所以5個中方格中酵母菌數(shù)不少于160。

（二）（1）將非洲爪蟾核糖體蛋白基因與質(zhì)粒重組后導入大腸桿菌細胞中進行了表達，說明體外重組的質(zhì)粒可以進入受體細胞；也可說明真核生物基因可在原核細胞中表達。

（2）噬菌體為DNA病毒，由DNA和蛋白質(zhì)組成，所以體外重組的噬菌體DNA通常需與蛋白質(zhì)外殼組裝才能形成完整噬菌體。噬菌體屬于細菌病毒，宿主細胞只能是細菌，所以在細菌、心肌細胞、葉肉細胞中，可作為重組噬菌體宿主細胞的是細菌。

（3）真核生物基因（目的基因）在大腸桿菌細胞內(nèi)表達時，表達出的蛋白質(zhì)可能會被降解，為防止蛋白質(zhì)被降解，選擇的大腸桿菌體內(nèi)應該沒有可以降解蛋白質(zhì)的酶，所以選擇蛋白酶缺陷型的大腸桿菌作為受體細胞，在蛋白質(zhì)純化的過程中應添加蛋白酶的抑制劑。