Question

【題目】為了增加菊花花色類型，研究者從其他植物中克隆出花色基因C（圖1），擬將其與質(zhì)粒（圖2）重組，再借助農(nóng)桿菌導(dǎo)入菊花中。請回答問題：

（1）科學(xué)家是利用RT-PCR技術(shù)（mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA再進(jìn)行PCR擴(kuò)增），獲得花色基因C，RT-PCR過程需要的酶有_____。在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時需要設(shè)計(jì)___種引物。

（2）將基因C與質(zhì)粒（圖2）重組，需要用到的酶有_____。本實(shí)驗(yàn)中，對質(zhì)粒進(jìn)行酶切時，只能單一酶切，不能雙酶切，原因是____________________。與雙酶切相比，單一酶切存在的缺點(diǎn)是________________（答出兩點(diǎn)）。

（3）把重組質(zhì)粒導(dǎo)入菊花細(xì)胞中，借助了農(nóng)桿菌，選用農(nóng)桿菌的原因是___________。

（4）在實(shí)驗(yàn)操作過程中，篩選被轉(zhuǎn)化的菊花細(xì)胞應(yīng)在培養(yǎng)基中添加_________。如要檢測基因C是否整合到菊花染色體的DNA上，應(yīng)采用__________技術(shù)。

Answer 1

【答案】逆轉(zhuǎn)錄酶和Taq酶（熱穩(wěn)定的DNA聚合酶） 2 EcoRI和DNA連接酶 基因C只有EcoRI的酶切位點(diǎn)，當(dāng)質(zhì)粒被同一種酶切割后產(chǎn)生同樣的末端，基因C才能和質(zhì)粒連接成環(huán)狀 目的基因會自身連接、載體會自身連接、目的基因與運(yùn)載體反向連接（任意兩點(diǎn)） 能感染菊花細(xì)胞、農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移至菊花細(xì)胞，且能整合到菊花細(xì)胞染色體DNA上 潮霉素 DNA分子雜交

【解析】

1、有關(guān)PCR技術(shù)的相關(guān)知識：

（1）概念：PCR全稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA的核酸合成技術(shù)。

（2）原理：DNA復(fù)制。

（3）前提條件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一對引物。

（4）過程：①高溫變性：DNA解旋過程；②低溫復(fù)性：引物結(jié)合到互補(bǔ)鏈DNA上；③中溫延伸：合成子鏈。PCR擴(kuò)增中雙鏈DNA解開不需要解旋酶，高溫條件下氫鍵可自動解開。

2、基因工程技術(shù)的基本步驟：

（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。

（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動子、終止子和標(biāo)記基因等。

（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入動物�?xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA—分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）根據(jù)題意可知，RT-PCR技術(shù)是mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA再進(jìn)行PCR擴(kuò)增的過程，其中逆轉(zhuǎn)錄過程需要逆轉(zhuǎn)錄酶，而PCR技術(shù)需要Taq酶（熱穩(wěn)定的DNA聚合酶）的催化。在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時需要設(shè)計(jì)兩種引物。

（2）將基因C與質(zhì)粒重組，需要用到的酶有EcoRI和DNA連接酶。本實(shí)驗(yàn)中，對質(zhì)粒進(jìn)行酶切時，只能單一酶切，不能雙酶切，原因是基因C只有EcoRI的酶切位點(diǎn)，當(dāng)質(zhì)粒被同一種酶切割后產(chǎn)生同樣的末端，基因C才能和質(zhì)粒連接成環(huán)狀。與雙酶切相比，單一酶切存在的缺點(diǎn)是目的基因會自身連接、載體會自身連接、目的基因與運(yùn)載體反向連接。

（3）借助了農(nóng)桿菌把重組質(zhì)粒導(dǎo)入到植物細(xì)胞，因?yàn)檗r(nóng)桿菌能感染菊花細(xì)胞、農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移至菊花細(xì)胞，且能整合到菊花細(xì)胞染色體DNA上。

（4）圖2中顯示標(biāo)記基因是潮霉素抗性基因，因此可在培養(yǎng)基中添加潮霉素，篩選被轉(zhuǎn)化的菊花細(xì)胞。檢測目的基因是否導(dǎo)入受體的細(xì)胞常用DNA分子雜交技術(shù)。