Question

17．融合PCR技術(shù)是采用具有互補(bǔ)末端的引物，將不同來源的擴(kuò)增片段連接起來的方法，其過程如圖1所示．圖2是中間載體1和中間載體2（利用融合PCR技術(shù)構(gòu)建成）構(gòu)建成葉綠體定點(diǎn)整合表達(dá)載體示意圖（限制酶酶切位點(diǎn)標(biāo)注于載體外側(cè)），葉綠體定點(diǎn)整合表達(dá)載體通過與葉綠體基因的同源重組，將目的基因整合于葉綠體DNA上的特定位點(diǎn)上．請(qǐng)據(jù)圖回答下列問題．

（1）圖1第一階段中PCR至少進(jìn)行2次循環(huán)，才能獲得雙鏈等長(zhǎng)的DNA，第二階段中引物2與引物3部分堿基的互補(bǔ)配對(duì)關(guān)系使得兩DNA能成功“搭橋”連接起來．
（2）若通過融合PCR技術(shù)將啟動(dòng)子、標(biāo)記基因、目的基因、終止子拼接起來，需要設(shè)計(jì)8種引物，其中能夠起著“搭橋”作用的引物有6種．
（3）圖2中需使用Spe I、Sal I（填限制酶）和DNA連接酶將兩中間載體構(gòu)建成定點(diǎn)整合表達(dá)載體，途中定點(diǎn)整合表達(dá)載體上未標(biāo)出的結(jié)構(gòu)是復(fù)制原點(diǎn)．
（4）葉綠體定點(diǎn)整合表達(dá)載體中葉綠體同源重組基因1和葉綠體同源重組基因2（填基因）能使目的基因準(zhǔn)確插入葉綠體DNA上的特定位點(diǎn)上．與利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法相比，利用定點(diǎn)整合表達(dá)載體將目的基因?qū)�入葉綠體中的優(yōu)點(diǎn)是能實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)整合到葉綠體中，且不易隨花粉擴(kuò)散帶來安全問題．

Answer 1

分析 1、限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）：能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開，因此具有專一性．
DNA連接酶：縫合磷酸二酯鍵．
2、PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因
（1）原理：DNA雙鏈復(fù)制
（2）過程：第一步：加熱至90～95℃DNA解鏈；第二步：冷卻到55～60℃，引物結(jié)合到互補(bǔ)DNA鏈；第三步：加熱至70～75℃，熱穩(wěn)定DNA聚合酶從引物起始互補(bǔ)鏈的合成．
3、基因表達(dá)載體的構(gòu)建目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳至下一代，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用．組成：目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因．根據(jù)圖2顯示，中間載體1的啟動(dòng)子一端有SpeI的切割位點(diǎn)和在終止子一端有SalI切割位點(diǎn)．并且“啟動(dòng)子-目的基因-終止子”這一段是插入在中間載體2的SpeI、SalI切割位點(diǎn)之間，因此構(gòu)建如圖的定點(diǎn)整合表達(dá)載體需使用SpeI、SalI和DNA連接酶．

解答 解：（1）根據(jù)圖示和PCR擴(kuò)增技術(shù)的特點(diǎn)，可以推導(dǎo)出圖1第一階段中PCR至少經(jīng)過2次循環(huán)才可以得到雙鏈等長(zhǎng)的DNA，如圖所示：

再根據(jù)圖1中第二階段是AB基因融合后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)需要引物1和引物4，可推導(dǎo)出第二階段中引物2與引物3部分堿基互不配對(duì)使得兩DNA能成功“搭橋”連接起來．
（2）若通過融合PCR技術(shù)將啟動(dòng)子、標(biāo)記基因、目的基因、終止子拼接起來，啟動(dòng)子與標(biāo)記基因連接需要2種引物部分堿基配對(duì)，同樣標(biāo)記基因和目的基因、目的基因、終止子連接也各需要2種引物，同時(shí)在搭建而成的長(zhǎng)的DNA分子的兩端各需要1種引物，所以最終需要設(shè)計(jì)1+2+2+2+1=8種引物，其中兩端的2種引物不能起“搭橋'的作用，因此能夠起著“搭橋”作用的引物有8-2=6種．
（3）根據(jù)圖2顯示，中間載體1的啟動(dòng)子一端有SpeI的切割位點(diǎn)和在終止子一端有SalI切割位點(diǎn)．并且“啟動(dòng)子-目的基因-終止子”這一段是插入在中間載體2的SpeI、SalI切割位點(diǎn)之間，因此構(gòu)建如圖的定點(diǎn)整合表達(dá)載體需使用SpeI、SalI和DNA連接酶．基因表達(dá)載體包括啟動(dòng)子、目的基因、終止子、標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)，途中定點(diǎn)整合表達(dá)載體上未標(biāo)出的結(jié)構(gòu)是復(fù)制原點(diǎn)．
（4）葉綠體定點(diǎn)整合表達(dá)載體中葉綠體同源重組基因1和葉綠體同源重組基因2能使目的基因準(zhǔn)確插入葉綠體DNA上的特定位點(diǎn)上．與利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法相比，利用定點(diǎn)整合表達(dá)載體將目的基因?qū)�入葉綠體中的優(yōu)點(diǎn)是能實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)整合到葉綠體中，且不易隨花粉擴(kuò)散帶來安全問題．
 故答案為：
（1）2    互補(bǔ)配對(duì)
（2）8    6
（3）Spe I、Sal I       復(fù)制原點(diǎn)
（4）葉綠體同源重組基因1和葉綠體同源重組基因2
能實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)整合到葉綠體中，且不易隨花粉擴(kuò)散帶來安全問題

點(diǎn)評(píng) 本題考查基因工程的相關(guān)知識(shí)，意在考查考生分析題文提取信息的能力；能理解所學(xué)知識(shí)要點(diǎn)，把握知識(shí)間內(nèi)在聯(lián)系的能力；能運(yùn)用所學(xué)知識(shí)和觀點(diǎn)，通過比較、分析與綜合等方法對(duì)某些生物學(xué)問題進(jìn)行解釋、推理，做出合理的判斷或得出正確的結(jié)論．