Question

4．已知圖1、圖2中標(biāo)注了相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)，且限制酶的切點(diǎn)是唯一 的，外源DNA插入會(huì)導(dǎo)致#應(yīng)的基因失活．請(qǐng)回答有關(guān)基因工程操作的問題：

（1）圖1表示的是1個(gè)經(jīng)過人工改造的作為載體的質(zhì)粒．作為基因表達(dá)載體除圖1所示結(jié)構(gòu)外，還需具有目的基因和終止子．
（2）根據(jù)圖中所給信息，構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，應(yīng)選用的限制酶是BclI和HindⅢ．若將基因表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌，一般先用鈣離子處理，使其成為感受態(tài)細(xì)胞，以利于吸收周圍環(huán)境中的DNA分子，然后調(diào)控溫度完成轉(zhuǎn)化過程．
（3）為了篩選出含目的基因的大腸桿菌，應(yīng)在培養(yǎng)基中添加四環(huán)素；培養(yǎng)一段時(shí)間后，平板上長(zhǎng)出菌落．用PCR技術(shù)鑒定時(shí)，所用的引物是圖2中引物甲和引物丙．PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，每一循環(huán)包括變性、復(fù)性（退火）、延伸三步．

Answer 1

分析 基因工程技術(shù)的基本步驟：
1、目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫(kù)中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成．
2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等．
3、將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣．將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入�?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法．
4、目的基因的檢測(cè)與鑒定：
（1）分子水平上的檢測(cè)：①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)．
（2）個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等．

解答 解：（1）圖1為質(zhì)粒，天然的質(zhì)粒不能直接作為載體，基因工程中用到的質(zhì)粒都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過人工改造的．基因表達(dá)載體的組成包括啟動(dòng)子、終止子、目的基因和標(biāo)記基因等，圖中已經(jīng)有啟動(dòng)子和標(biāo)記基因（四環(huán)素抗性基因），還缺少目的基因和終止子．
（2）選擇的限制酶應(yīng)在目的基因兩端存在識(shí)別位點(diǎn)，但BamHⅠ可能使質(zhì)粒中的啟動(dòng)子丟失，因此只能選BclI和HindⅢ兩種限制酶切割．將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞常用感受態(tài)細(xì)胞法，即用Ca²⁺處理，使其處于易于吸收周圍環(huán)境中DNA分子的感受態(tài)，然后讓基因表達(dá)載體在緩沖液中與該細(xì)胞混合，調(diào)控溫度完成轉(zhuǎn)化過程．
（3）由圖可知，標(biāo)記基因是四環(huán)素抗性基因，因此要篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，應(yīng)在培養(yǎng)基中添加四環(huán)素．PCR技術(shù)要求兩種引物分別和目的基因的兩條單鏈結(jié)合，沿相反的方向合成子鏈，故所用的引物組成為圖2中引物甲和引物丙．PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，每一循環(huán)包括變性、復(fù)性、延伸三步．
故答案為：
（1）人工改造           目的基因和終止子
（2）BclI和HindⅢ吸收周圍環(huán)境中的DNA分子
（3）四環(huán)素       引物甲和引物丙     復(fù)性（退火）     延伸

點(diǎn)評(píng) 本題結(jié)合基因結(jié)構(gòu)圖和運(yùn)載體結(jié)構(gòu)圖，考查基因工程的技術(shù)和原理，重點(diǎn)是限制酶和DNA連接酶，要求考生認(rèn)真分析圖1和圖2，能根據(jù)圖中和表中信息選擇合適的限制酶，準(zhǔn)確判斷使用DNA連接酶連接的結(jié)果，再運(yùn)用所學(xué)的知識(shí)答題．