Question

【題目】植物基因工程中，往往用光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(PrbcS)使目的基因表達(dá)，其結(jié)合T基因后能使目的基因更高水平表達(dá)。下圖中①和②都為基因表達(dá)載體構(gòu)建過(guò)程中的中間載體，請(qǐng)分析重組載體的部分構(gòu)建過(guò)程并回答下列問(wèn)題：

注：Ampr/Kmr分別為氨芐青霉素/卡那霉素抗性基因。origin為復(fù)制原點(diǎn)，其余為限制酶切位點(diǎn)。

(1) 對(duì)雙子葉植物進(jìn)行基因工程改造最常用的方法是____________，還需結(jié)合____________技術(shù)才能獲得新性狀的植株。

(2) 中間載體通常用________法導(dǎo)入微生物中擴(kuò)增，含有中間載體②PrbcS*T的微生物與含有中間載體①PrbcS*T的微生物相比，區(qū)別兩者差別的方法是____________________________。

(3) 經(jīng)酶切后凝膠電泳，測(cè)得2B片段為0.4kb，經(jīng)圖示信息分析，Prbcs*T的長(zhǎng)度約為________。寫出中間載體②Prbcs*T圖中問(wèn)號(hào)處限制酶的酶切位點(diǎn)：________________________。

(4) 如何在T基因前“點(diǎn)突變引入NcoⅠ”酶切位點(diǎn)？ ___________________。

Answer 1

【答案】農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 植物組織培養(yǎng)技術(shù) 感受態(tài)細(xì)胞法 含有中間載體②PrbcS*T的微生物能在含有卡那霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而不能在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)(或含有中間載體①PrbcS*T的微生物能在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而不能在含有卡那霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)) 1.7 kb SphⅠ、BamHⅠ、EcoRⅠ、NotⅠ、XhoⅠ、EcoRⅤ 設(shè)計(jì)包含NcoⅠ識(shí)別序列的引物，然后用PCR技術(shù)擴(kuò)增

【解析】

基因工程中目的基因?qū)�入的受體細(xì)胞不同，選用的方法不同，一般導(dǎo)入雙子葉植物常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞常用顯微注射法，導(dǎo)入微生物常用感受態(tài)法。運(yùn)載體上常含有標(biāo)記基因，可用來(lái)篩選目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞。

（1）將目的基因?qū)�入雙子葉植物常利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。要想獲得轉(zhuǎn)基因植物，還需要對(duì)導(dǎo)入目的基因的受體細(xì)胞進(jìn)行植物組織培養(yǎng)。

（2）將中間載體導(dǎo)入微生物時(shí)常先用鈣離子處理微生物使其成為感受態(tài)，易于吸收中間載體，該種方法為感受態(tài)細(xì)胞法。由圖可知，中間載體②上含卡那霉素抗性基因，而不含氨芐青霉素抗性基因，故含有中間載體②PrbcS*T的微生物能在含有卡那霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而不能在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。

（3）由圖可知，中間載體②的長(zhǎng)度為2.7kb，經(jīng)酶切后凝膠電泳，測(cè)得2B片段為0.4kb，設(shè)Prbcs*T的長(zhǎng)度為y，則2.7-0.4+y=4kb，解得y=1.7kb。根據(jù)圖示中中間載體①PrbcS*T右側(cè)的酶切位點(diǎn)和中間載體②-2B右側(cè)的酶切位點(diǎn)可知，中間載體②Prbcs*T圖中問(wèn)號(hào)處限制酶的酶切位點(diǎn)可為SphⅠ、BamHⅠ、EcoRⅠ、NotⅠ、XhoⅠ、EcoRⅤ的酶切位點(diǎn)。

（4）可設(shè)計(jì)包含NcoⅠ識(shí)別序列的引物，然后用PCR技術(shù)擴(kuò)增，即可在T基因前“點(diǎn)突變引入NcoⅠ”酶切位點(diǎn)。