Question

【題目】基因工程又稱基因拼接技術(shù)和DNA重組技術(shù)，是以分子遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段。如圖是基因工程示意圖，請據(jù)圖回答下列問題：

（1）利用PCR技術(shù)對目的基因進行擴增時，需加入____________酶。該技術(shù)依據(jù)的原理是____________，在操作步驟中需要加熱至90～95℃使____________，然后降溫至55～60℃，使________________________。

（2）進行①過程時，需用________________________酶切開載體以插入目的基因。若要使目的基因在受體細胞中表達，需要導(dǎo)入基因表達載體，而不是直接導(dǎo)入目的基因，其原因是：________________________________________________（答出兩點即可）。

（3）若圖中宿主細胞為大腸桿菌，一般情況下②過程采用____________處理大腸桿菌，使其成為感受態(tài)細胞 。

（4）真核生物基因（目的基因）在大腸桿菌細胞內(nèi)表達時，表達出的蛋白質(zhì)可能會被降解。為防止蛋白質(zhì)被降解，在實驗中應(yīng)選用________________________缺陷型的大腸桿菌作為受體細胞，并在蛋白質(zhì)純化的過程中應(yīng)添加蛋白酶的抑制劑。

Answer 1

【答案】具熱穩(wěn)定性的DNA聚合酶（Taq酶） DNA半保留復(fù)制 DNA解旋 引物結(jié)合到互補DNA鏈 限制（或限制性核酸內(nèi)切） 目的基因無復(fù)制原點、目的基因無表達所需啟動子目的基因無表達所需的終止子 Ca2+ 蛋白酶

【解析】

基因工程技術(shù)的基本步驟：

（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴增和人工合成。

（2）基因表達載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。

（3）將目的基因?qū)�入受體細胞：根據(jù)受體細胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)�入植物細胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物細胞的方法是感受態(tài)細胞法。

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）利用PCR技術(shù)擴增目的基因時，需要特殊的耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）；PCR的原理是DNA的半保留復(fù)制；其具體操作是將DNA分子加熱至90～95℃使DNA解旋；然后降溫至55～60℃，使引物結(jié)合到互補DNA鏈。

（2）構(gòu)建基因表達載體，需要用限制酶或限制性核酸內(nèi)切酶切開載體以插入目的基因；由于目的基因無復(fù)制原點、目的基因無表達所需啟動子，目的基因無表達所需的終止子，所以不能直接導(dǎo)入目的基因。

（3）如果受體細胞是大腸桿菌需要用Ca2+處理大腸桿菌。

（4）蛋白質(zhì)可以被蛋白酶分解，所以為防止蛋白質(zhì)被降解，可以選用蛋白酶缺陷型的細菌作為受體細胞。