Question

【題目】圖1為某一質(zhì)粒載體，外源DNA分子插入到Ampr或Tetr中會導(dǎo)致相應(yīng)的基因失活(Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環(huán)素抗性基因)。圖2中的三個DNA片段上依次表示出了EcoR I、BamH I和Sau3A I三種限制性內(nèi)切酶的識別序列與切割位點�；卮鹣铝杏嘘P(guān)基因工程的問題：

(1)經(jīng)Sau3A I酶切割得到的目的基因可以與上述表達載體被____酶切后的產(chǎn)物連接，理由是_____________。

(2)DNA連接酶是將兩個DNA片段連接起來的酶，其中既能連接黏性末端又能連接平末端的是_____。用DNA連接酶處理限制酶切產(chǎn)物得到的混合物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，結(jié)果大腸桿菌有的未被轉(zhuǎn)化，有的被轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質(zhì)粒載體、含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌。首先用含有_____培養(yǎng)基進行篩選，上述大腸桿菌細胞中，_____不能在培養(yǎng)基生存，但是含有______的細胞也是不能區(qū)分的，其原因是_______________。在上述篩選的基礎(chǔ)上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落，還需使用含有_____________的固體培養(yǎng)基。

Answer 1

【答案】BamHⅠ 兩種酶切割后產(chǎn)生的片段具有相同的黏性末端 T4DNA連接酶 四環(huán)素 未被轉(zhuǎn)化的和僅含環(huán)狀目的基因的大腸桿菌 質(zhì)粒載體和插入了目的基因的重組質(zhì)粒 二者均含有四環(huán)素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均生長 氨芐青霉素

【解析】

1、運載體：

（1）常用的運載體：質(zhì)粒、噬菌體的衍生物、動植物病毒。

（2）作為運載體必須具備的條件：①要具有限制酶的切割位點； ②要有標(biāo)記基因（如抗性基因），以便于重組后重組子的篩選③能在宿主細胞中穩(wěn)定存在并復(fù)制；④是安全的，對受體細胞無害，而且要易從供體細胞分離出來。

2、識圖分析可知，圖1中的質(zhì)粒上Amp′表示氨芐青霉素抗性基因，Tet′表示四環(huán)素抗性基因，可以作為標(biāo)記基因，限制酶EcoR I、BamH I的酶切位點位于Amp′氨芐青霉素抗性基因中。

圖2依次表示出了EcoR I、BamH I和Sau3A I三種限制性內(nèi)切酶的識別序列與切割位點，分析圖可知，限制酶BamH I和Sau3A I切割后形成的黏性末端序列可以互補配對。

（1）分析圖解可知，限制酶Sau3AⅠ和BamHⅠ酶切割后形成的黏性末端相同，因此經(jīng)BamHⅠ酶切割得到的目的基因可以與表達載體被Sau3AⅠ酶切后的產(chǎn)物連接。

（2）DNA連接酶是將兩個DNA片段連接起來的酶，包括T4DNA連接酶和E.coliDNA連接酶，其中T4DNA連接酶既能連接黏性末端又能連接平末端。用得到的混合物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，結(jié)果大腸桿菌有的未被轉(zhuǎn)化，有的被轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種，分別是僅含有環(huán)狀目的基因、含有質(zhì)粒載體、含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒。由于BamHⅠ酶會破壞青霉素抗性基因，因此含有目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌不能產(chǎn)生抗青霉素物質(zhì)，四環(huán)素抗性基因沒有破壞，能產(chǎn)生抗四環(huán)素的物質(zhì)，因此該大腸桿菌能抗四環(huán)素素而不能抗氨芐青霉素; 僅含有環(huán)狀目的基因的沒有標(biāo)記基因存在，因此既不能抗青霉素也不能抗四環(huán)素；含有質(zhì)粒載體的既可以抗青霉素也可以抗四環(huán)素。所以首先用含四環(huán)素的培養(yǎng)基分離微生物，其中未被轉(zhuǎn)化的和僅含環(huán)狀目的基因的大腸桿菌不能在培養(yǎng)基生存，但是含有質(zhì)粒載體和插入了目的基因的重組質(zhì)粒的細胞能夠生存下來，二者不能區(qū)分，若要區(qū)分二者，還需使用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基篩選，其中含有質(zhì)粒載體的能夠生存。