Question

【題目】圖（a）中的三個(gè)DNA片段上依次表示出了EcoRI、BamHI和Sau3AI三種限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列與切割位點(diǎn)，圖（b）為某種表達(dá)載體示意圖（載體上的EcoRI、Sau3AI的切點(diǎn)是唯一的）。

根據(jù)基因工程的有關(guān)知識(shí)，回答下列問(wèn)題：

（1）經(jīng)BamHI酶切割得到的目的基因可以與上述表達(dá)載體被_____________酶切后的產(chǎn)物連接，理由是兩種酶切割后產(chǎn)生的片段具有相同的黏性末端是 ___________________________________

（2）若某人利用圖（b）所示的表達(dá)載體獲得了甲、乙、丙三種含有目的基因的重組子，如圖（c）所示。這三種重組子中，不能在宿主細(xì)胞中表達(dá)目的基因產(chǎn)物的有______，不能表達(dá)的原因是_____________________________________________________________________________。

（3）DNA連接酶是將兩個(gè)DNA片段連接起來(lái)的酶，常見(jiàn)的有____________和____________，其中既能連接黏性末端又能連接平末端的是_____________。

Answer 1

【答案】Sau3AⅠ -——CTAG 甲和丙 甲中目的基因插入在啟動(dòng)子的上游，丙中目的基因插入在終止子的下游，二者的目的基因均不能被轉(zhuǎn)錄 E．coliDNA連接酶 T4DNA連接酶 T4DNA連接酶

【解析】

1、“分子手術(shù)刀”--限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）：
（1）來(lái)源：主要是從原核生物中分離純化出來(lái)的。
（2）功能：能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開(kāi)，因此具有專一性。
（3）結(jié)果：經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段末端通常有兩種形式：黏性末端和平末端。
2、“分子縫合針”--DNA連接酶：
（1）兩種DNA連接酶（EcoliDNA連接酶和T4DNA連接酶）的比較：
①相同點(diǎn)：都縫合磷酸二酯鍵。
②區(qū)別：EcoliDNA連接酶來(lái)源于大腸桿菌，只能將雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端之間的磷酸二酯鍵連接起來(lái)；而T4DNA連接酶來(lái)源于T4噬菌體，可用于連接粘性末端和平末端，但連接效率較低。
（2）與DNA聚合酶作用的異同：DNA聚合酶只能將單個(gè)核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯鍵。DNA連接酶是連接兩個(gè)DNA片段的末端，形成磷酸二酯鍵。
3、基因表達(dá)載體的組成：目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因。
（1）啟動(dòng)子：是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得所需的蛋白質(zhì)。
（2）終止子：也是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的尾端。
（3）標(biāo)記基因的作用：是為了鑒定受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)。常用的標(biāo)記基因是抗生素基因。

（1）分析圖解可知，限制酶Sau3AI和BamHI酶切割后形成的黏性末端相同，均為-——CTAG，因此經(jīng)BamHI酶切割得到的目的基因可以與上述表達(dá)載體被Sau3AI酶切后的產(chǎn)物連接。
（2）在基因表達(dá)載體中，啟動(dòng)子位于目的基因的首端，終止子應(yīng)位于目的基因的尾端，插入到啟動(dòng)子和終止子之間的目的基因才能表達(dá)，而圖中甲中目的基因插入在啟動(dòng)子的上游，丙中目的基因插入在終止子的下游，甲和丙的結(jié)構(gòu)均不符合目的基因表達(dá)的條件，所以不能在宿主細(xì)胞中表達(dá)目的基因產(chǎn)物。
（3）DNA連接酶是將兩個(gè)DNA片段連接起來(lái)的酶，常見(jiàn)的有EcoliDNA連接酶和T4DNA連接酶，其中既能連接黏性末端又能連接平末端的是T4DNA連接酶。