Question

【題目】實時熒光定量PCR簡稱qPCR，靈敏度高特異性好，是目前檢測微小殘留病變的常用方法。將標有熒光素的Taqman探針與待測樣本DNA混合后，在變性、復(fù)性、延伸的熱循環(huán)中，與待測樣本DNA配對結(jié)合的Taqman探針被Taq酶切斷，在特定光激發(fā)下發(fā)出熒光（如下圖所示），隨著循環(huán)次數(shù)的增加，熒光信號強度增加，通過實時檢測熒光信號強度，可得Ct值（該值與待測樣本中目的基因的個數(shù)呈負相關(guān)）。

（1）做qPCR之前，需要先根據(jù)目的基因的核苷酸序列合成__________。除此之外，qPCR的反應(yīng)體系還需要加入___________、_________和___________。

（2）在反應(yīng)過程中，___________為新鏈的合成提供能量。

（3）醫(yī)務(wù)人員對三位慢性粒細胞白血病患者（由B基因過量表達導(dǎo)致）進行治療后，想檢測治療效果，利用上述技術(shù)寫出實驗思路和簡要結(jié)果分析。

實驗思路：__________________簡要結(jié)果_____________________________

Answer 1

【答案】引物和Taqman探針 待測樣本（模板DNA） dNTP 熱穩(wěn)定的DNA聚合酶（Taq酶） dNTP 三位患者分別編號甲、乙、丙，分別抽取適量血樣提取RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，根據(jù)B基因的序列設(shè)計引物和探針，進行PCR擴增，檢測熒光信號強度 三位患者檢測的Ct值越小，說明治療效果越好，反之，治療效果越差

【解析】

PCR技術(shù)：

1、概念：PCR全稱為聚合酶鏈式反應(yīng)，是一項在生物體外復(fù)制特定DNA的核酸合成技術(shù)。

2、原理：DNA復(fù)制。

3、前提條件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一對引物。

4、條件：模板DNA、四種脫氧核苷酸、一對引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）。

5、過程：①高溫變性：DNA解旋過程（PCR擴增中雙鏈DNA解開不需要解旋酶，高溫條件下氫鍵可自動解開）；低溫復(fù)性：引物結(jié)合到互補鏈DNA上；③中溫延伸：合成子鏈。

（1）PCR需要根據(jù)目的基因的核苷酸序列合成引物，同時qPCR還需要Taqman探針與待測樣本DNA混合，所以還需要合成Taqman探針；在反應(yīng)體系中還需要添加待測樣本（模板DNA）、dNTP、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶（Taq酶）。

（2）在反應(yīng)過程中，dNTP為新鏈的合成提供能量。

（3）根據(jù)題干信息“將標有熒光素的Taqman探針與待測樣本DNA混合后，在變性、復(fù)性、延伸的熱循環(huán)中，與待測樣本DNA配對結(jié)合的Taqman探針被Taq酶切斷，在特定光激發(fā)下發(fā)出熒光，通過實時檢測熒光信號強度，可得Ct值（該值與待測樣本中目的基因的個數(shù)呈負相關(guān)）”；

所以設(shè)計實驗思路：三位患者分別編號甲、乙、丙，分別抽取適量血樣提取RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，根據(jù)B基因的序列設(shè)計引物和探針，進行PCR擴增，檢測熒光信號強度；

結(jié)果：Ct值越小，說明治療效果越好，反之，治療效果越差。