Question

4．1994年，科研人員發(fā)現(xiàn)一株擬南芥突變株，由于NPR1基因突變，使其系統(tǒng)獲得性抗性相關(guān)蛋白基因的應(yīng)答性表達(dá)被徹底破壞，后來采用定位克隆技術(shù)從擬南芥中克隆到了NPR1基因，發(fā)現(xiàn)它的表達(dá)與植物抗細(xì)菌和真菌毒性提高有關(guān)．以NPR1基因作為目的基因可人工獲得抗性植株．請(qǐng)回答：
（1）抗性相關(guān)蛋白基因的應(yīng)答性表達(dá)過程包括轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)步驟．從野生擬南芥中分離出NPR1基因的mRNA后，以其為模板可逆轉(zhuǎn)錄出目的片段，然后用PCR技術(shù)可實(shí)現(xiàn)目的片段的克�。�與生物體內(nèi)的DNA復(fù)制相比，PCR技術(shù)的特殊之處有離體條件、需要高溫或高溫酶（答出兩項(xiàng)）等．
（2）由于DNA復(fù)制時(shí)，子鏈只能由5'向3'方向延伸，故利用PCR擴(kuò)增NPR1基因時(shí)，可以從圖1的A、B、C、D四種單鏈DNA片段中選取B和C作為引物．PCR擴(kuò)增進(jìn)行50個(gè)循環(huán)后，理論上可以產(chǎn)生約為2⁵⁰個(gè)DNA分子，將這些DNA分子與載體連接后儲(chǔ)存在一個(gè)受體菌群中，這個(gè)受體菌群就叫做擬南芥的cDNA文庫（或部分基因文庫），擴(kuò)增獲得的目的基因與擬南芥細(xì)胞中該基因堿基序列不同（填“相同”或“不同”）．

（3）將人工合成的NPR1基因?qū)�入普通植物之前，需要�?gòu)建含有NPR1基因的基因表達(dá)載體．對(duì)NPR1基因片段和質(zhì)粒（圖2所示）進(jìn)行酶切時(shí)，可選用限制酶的組合為HindⅢ和PstⅠ或EcoRⅠ和PstⅠ．

Answer 1

分析 1、基因工程又叫DNA重組技術(shù)，是指按照人們的意愿，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，并通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品．
2、基因工程的工具：
（1）限制酶：能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂．
（2）DNA連接酶：連接的是兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵．
（3）運(yùn)載體：常用的運(yùn)載體：質(zhì)粒、噬菌體的衍生物、動(dòng)植物病毒．
3、PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因
（1）原理：DNA雙鏈復(fù)制
（2）過程：第一步：加熱至90～95℃DNA解鏈；第二步：冷卻到55～60℃，引物結(jié)合到互補(bǔ)DNA鏈；第三步：加熱至70～75℃，熱穩(wěn)定DNA聚合酶從引物起始互補(bǔ)鏈的合成．
4、根據(jù)圖1、2顯示：SmaI切割位點(diǎn)在綠色熒光蛋白基因上并會(huì)破壞NPR1基因，不能使用SmaI．又因?yàn)樵贜PR1基因左端只有PstI一種酶的切割位點(diǎn)，在右側(cè)有HindIII、EcoRI2個(gè)切割位點(diǎn)，因此對(duì)NPR1基因片段和質(zhì)粒（圖2所示）進(jìn)行酶切時(shí)，可選用限制酶的組合為HindⅢ和PstI或EcoRⅠ和Pst．

解答 解：（1）基因表達(dá)過程包括轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)步驟．以mRNA為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生單鏈DNA，再進(jìn)一步產(chǎn)生雙鏈DNA，即目的基因片段．PCR技術(shù)與生物體內(nèi)的DNA復(fù)制相比，PCR技術(shù)的特殊之處有：離體條件、需要高溫或高溫酶等．
（2）DNA分子兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械年P(guān)系，又因?yàn)镈NA復(fù)制時(shí)子鏈只能由5'向3'方向延伸，因此A、B、C、D四種單鏈DNA片段中選取B和C作為引物．PCR擴(kuò)增以2ⁿ形式擴(kuò)增，進(jìn)行50個(gè)循環(huán)后，理論上可以產(chǎn)生約為2⁵⁰個(gè)DNA分子．這些DNA只是某生物體部分DNA，因此將這些DNA分子與載體連接后儲(chǔ)存在一個(gè)受體菌群中，這個(gè)受體菌群就叫做擬南芥的cDNA文庫（或部分基因文庫）．這些DNA分子中不含有非編碼區(qū)、內(nèi)含子，擴(kuò)增獲得的目的基因與擬南芥細(xì)胞中該基因堿基序列不同．
（3）將人工合成的NPR1基因?qū)�入普通植物之前，需要�?gòu)建含有NPR1基因的基因表達(dá)載體．根據(jù)圖1、2顯示：SmaI切割位點(diǎn)在綠色熒光蛋白基因上并會(huì)破壞NPR1基因，不能使用SmaI．又因?yàn)樵贜PR1基因左端只有PstI一種酶的切割位點(diǎn)，在右側(cè)有HindIII、EcoRI2個(gè)切割位點(diǎn)，因此對(duì)NPR1基因片段和質(zhì)粒（圖2所示）進(jìn)行酶切時(shí)，可選用限制酶的組合為HindⅢ和PstI或EcoRⅠ和Pst．
故答案為：
（1）轉(zhuǎn)錄和翻譯      逆轉(zhuǎn)錄     離體條件、需要高溫或高溫酶
（2）B和C           2⁵⁰cDNA文庫（或部分基因文庫）     不同
（3）含有NPR1基因的基因表達(dá)載體      HindⅢ和PstⅠEcoRⅠ和PstⅠ

點(diǎn)評(píng) 本題考查DNA分子的結(jié)構(gòu)和基因工程的相關(guān)知識(shí)，解題前提是熟記基因工程的原理、操作工具和操作步驟，之后根據(jù)圖中的信息，推斷出構(gòu)建基因表達(dá)載體所需的限制酶．本題要求考生具有一定的識(shí)記能力和分析能力，難度適中．