Question

4．在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中，常在飼料中加入一定量的尿素來飼養(yǎng)牛等牲畜。因其有特殊的器官——瘤胃，在瘤胃中生活著多種微生物，其中許多微生物以尿素作為唯一氮源。某同學(xué)設(shè)計(jì)了如下實(shí)驗(yàn)，對能分解尿素的細(xì)菌進(jìn)行分離和計(jì)數(shù)。

Ⅰ.取樣：到屠宰場，在剛宰殺的牛的瘤胃中取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中密封。

Ⅱ.制備培養(yǎng)基：制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基。將菌液稀釋相同的倍數(shù)，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)應(yīng)明顯多于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目。由于初次實(shí)驗(yàn)，選擇了一個較寬的稀釋范圍。并且每個稀釋度下需要3個選擇培養(yǎng)基，1個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

Ⅲ.微生物的培養(yǎng)與觀察：按稀釋度的順序分別吸取 0.1 mL進(jìn)行平板涂布操作。將涂布好的培養(yǎng)皿放在30 ℃下培養(yǎng)，并且需要無氧條件。比較兩種培養(yǎng)基中菌落的數(shù)量、形態(tài)等，并做好記錄。挑選選擇培養(yǎng)基上不同形態(tài)的菌落接入含酚紅指示劑的培養(yǎng)基中，觀察是否產(chǎn)生顏色反應(yīng)。

Ⅳ.細(xì)菌的計(jì)數(shù)：當(dāng)菌落數(shù)目穩(wěn)定時，選取平板計(jì)數(shù)。

請回答下列問題：

(1)制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的目的是什么？

(2)為什么每個稀釋度下需要3個選擇培養(yǎng)基？

(3)上述培養(yǎng)時，為什么需要無氧條件？

(4)含酚紅的培養(yǎng)基應(yīng)用的目的是什么？結(jié)果會呈現(xiàn)什么樣的顏色反應(yīng)？原理是什么？

(5)計(jì)數(shù)時應(yīng)選什么樣的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)？怎樣計(jì)算出樣品中的細(xì)菌數(shù)目？

Answer 1

答案：(1)作為對照，用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用。

(2)每個稀釋度下涂布3個平板，是作為重復(fù)組，以增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的說服力與準(zhǔn)確性。

(3)由于瘤胃中的微生物多為厭氧菌，接觸空氣會受抑制甚至死亡。

(4)鑒別，看是否有分解尿素的細(xì)菌存在。如有該細(xì)菌存在結(jié)果會變紅。原理是分解尿素的細(xì)菌產(chǎn)生脲酶，催化尿素分解產(chǎn)生NH₃，使培養(yǎng)基 pH升高，酚紅指示劑呈紅色。

(5)選擇菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。根據(jù)平板所對應(yīng)的稀釋度，對3個平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)。然后求出平均值，以此估算樣品中細(xì)菌的數(shù)目。

解析：本題是從反芻動物瘤胃中分離分解尿素的細(xì)菌的過程，是對利用選擇培養(yǎng)基分離目的菌株基礎(chǔ)知識的鞏固，解題時注意以下問題：

(1)要設(shè)立基礎(chǔ)培養(yǎng)基——牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為對照，觀察選擇培養(yǎng)基是否具選擇作用。

(2)要設(shè)立重復(fù)組，取平均值，如每一稀釋度下涂布至少3個平板，以增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的說服力與準(zhǔn)確性。

(3)瘤胃是一個缺氧環(huán)境，生活的微生物多為厭氧菌，分離時要注意創(chuàng)造無氧環(huán)境。

(4)進(jìn)一步鑒別分解尿素的細(xì)菌需在培養(yǎng)基中加酚紅指示劑，若此種菌存在，則會變紅，原理是分解尿素的細(xì)菌能產(chǎn)生脲酶，催化反應(yīng)：CO(NH₂)₂＋H₂OCO₂＋NH₃。因產(chǎn)生NH₃，使培養(yǎng)基堿性增強(qiáng)，pH升高，因此酚紅指示劑呈現(xiàn)紅色反應(yīng)。

(5)為保證結(jié)果準(zhǔn)確，計(jì)數(shù)應(yīng)選擇菌落數(shù)在30～300的平板。