Question

【題目】目前基因工程所用的質(zhì)粒載體主要是以天然細(xì)菌質(zhì)粒的各種元件為基礎(chǔ)重新組建的人工質(zhì)粒，pBR322質(zhì)粒是較早構(gòu)建的質(zhì)粒載體，其主要結(jié)構(gòu)如圖一所示：

（1）構(gòu)建人工質(zhì)粒時(shí)要有抗性基因，以便于___________________。

（2）對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增的常用方法是PCR，該技術(shù)所依據(jù)的原理是__________________，PCR擴(kuò)增某目的基因時(shí)需要引物___________種，擴(kuò)增時(shí)，每個(gè)循環(huán)一般需要經(jīng)過“變性、退火、延伸”三個(gè)過程，其中______過程的溫度設(shè)定是擴(kuò)增成敗的關(guān)鍵。PCR中用到的酶為 _____________ 酶。

（3）若用噬菌體替代質(zhì)粒作為運(yùn)載體構(gòu)建基因表達(dá)載體的過程中，是否需要利用CaCl2處理大腸桿菌，制備感受態(tài)細(xì)胞_______（需要 不需要） ，原因是_______________ 。

（4）用BamHI處理目的基因和質(zhì)粒后用DNA連接酶連接獲得重組質(zhì)粒，為了檢測(cè)該重組質(zhì)粒是否導(dǎo)入原本無ampR和tetR的大腸桿菌，將大腸桿菌在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到如圖二的菌落。再將滅菌絨布放到培養(yǎng)基上，使絨布面沾上菌落，然后將絨布放到含四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到如圖三的結(jié)果(空圈表示與圖二對(duì)照無菌落的位置)。與圖三空圈相對(duì)應(yīng)的圖二中的菌落表現(xiàn)型是 _____________________________圖三結(jié)果顯示，少數(shù)大腸桿菌導(dǎo)入的是 ______________ 。

Answer 1

【答案】鑒別目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞 DNA雙鏈復(fù)制 2 退火 Taq酶 不需要 噬菌體能通過侵染過程將自身的DNA注入到大腸桿菌中 能抗氨芐青霉素，但不能抗四環(huán)素 重組質(zhì)粒（基因表達(dá)載體）

【解析】

基因工程技術(shù)的基本步驟：
（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。
（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。
（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入�?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。
（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定：分子水平上的檢測(cè)：①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)。個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）質(zhì)粒上的抗性基因常作為標(biāo)記基因，其作用是鑒別目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞。
（2）PCR技術(shù)的原理是DNA雙鏈復(fù)制。PCR擴(kuò)增某目的基因時(shí)需要2種引物，擴(kuò)增時(shí)，每個(gè)循環(huán)一般需要經(jīng)過“變性、退火、延伸”三個(gè)過程，其中退火過程的溫度設(shè)定是擴(kuò)增成敗的關(guān)鍵。PCR中用到的酶為Taq 酶，該酶耐高溫。
（3）由于噬菌體能通過侵染過程將自身的DNA注入到大腸桿菌中，因此用噬菌體替代質(zhì)粒作為運(yùn)載體構(gòu)建基因表達(dá)載體的過程中，不需要利用CaCl2處理大腸桿菌，制備感受態(tài)細(xì)胞。
（4）用BamHⅠ處理目的基因和質(zhì)粒后用DNA連接酶連接獲得重組質(zhì)粒，由于BamHⅠ處理質(zhì)粒后破壞了四環(huán)素抗性基因，但沒有破壞氨芐青霉素抗性基因，因此成功導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌能能抗氨芐青霉素，但不能抗四環(huán)素，即圖三空圈對(duì)應(yīng)的圖二中的菌落能抗氨芐青霉素，但不能抗四環(huán)素。圖三中空圈較少，這說明少數(shù)大腸桿菌導(dǎo)入的是重組質(zhì)粒（基因表達(dá)載體）。