Question

16．GDNF是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子．對損傷的神經(jīng)細(xì)胞具有營養(yǎng)和保護(hù)作用．研究人員構(gòu)建了含GDNF基因的表達(dá)載體（如圖所示），并導(dǎo)入到大鼠神經(jīng)干細(xì)胞中，用于干細(xì)胞基因治療的研究．請回答：

（1）完成圖中A過程必需的工具是限制酶和DNA連接酶；該基因治療的受體細(xì)胞為神經(jīng)干細(xì)胞．
（2）基因工程最核心的步驟是構(gòu)建基因表達(dá)載體．
（3）若要構(gòu)建含GDNF基因的表達(dá)載體，則需選擇圖中的XhoⅠ限制酶進(jìn)行酶切．
（4）限制酶XhoI和限制酶HpaI的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)分別是-C↓AATTG-和-G↓AATTC-．如下圖表示四種質(zhì)粒，其中，箭頭所指部位為酶的識(shí)別位點(diǎn)，質(zhì)粒的陰影部分表示標(biāo)記基因．適于作為圖示GDNF基因運(yùn)載體的是A．

（5）下列有關(guān)限制性核酸內(nèi)切酶和質(zhì)粒運(yùn)載體的描述，正確的是C．
A．限制性核酸內(nèi)切酶能識(shí)別DNA、切割DNA任一序列
B．限制性核酸內(nèi)切酶的作用部位與RNA聚合酶的相同
C．使用質(zhì)粒運(yùn)載體是為了避免目的基因被分解
D．質(zhì)粒運(yùn)載體可能是從細(xì)菌或者病毒的DNA改造的
（6）經(jīng)酶切后的載體和GDNF基因進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物經(jīng)篩選得到的載體主要有三種：單個(gè)載體自連、GDNF基因與載體正向連接、GDNF基因與載體反向連接（如圖所示）．為鑒定這3種連接方式，選擇HpaI酶和BamHI酶對篩選的載體進(jìn)行雙酶切，若是正向連接的重組載體，其產(chǎn)生的酶切片段數(shù)為2個(gè)，反向連接的重組載體產(chǎn)生片段有②⑥（多選）．
①100bp  ②200bp  ③600bp   ④700bp  ⑤6000bp  ⑥6500bp．

Answer 1

分析 基因工程技術(shù)的基本步驟：
（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成．
（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等．
（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣．將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入�?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法．
（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)．個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等．

解答 解：（1）圖中A表示基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程，該過程中需要先用限制酶切割含有目的基因的外源DNA分子和運(yùn)載體，其次還需要用DNA連接酶將目的基因與運(yùn)載體連接形成重組DNA分子；根據(jù)題干信息“導(dǎo)入到大鼠神經(jīng)干細(xì)胞中”可知，該基因治療的受體細(xì)胞為神經(jīng)干細(xì)胞．
（2）基因工程的核心步驟是構(gòu)建基因表達(dá)載體．
（3）質(zhì)粒上有XhoⅠ識(shí)別位點(diǎn)，而且在啟動(dòng)子之后，所以要構(gòu)建含GDNF基因的表達(dá)載體，應(yīng)選用XhoⅠ限制酶進(jìn)行酶切．
（4）A、該質(zhì)粒中含有限制酶XhoI的切割位點(diǎn)，且切割位點(diǎn)不在標(biāo)記基因上，可作為基因的運(yùn)載體，A正確；
B、該質(zhì)粒不含標(biāo)記基因，不可位于基因的運(yùn)載體，B錯(cuò)誤；
C、該質(zhì)粒含有標(biāo)記基因和限制酶HpaI，但切割位點(diǎn)位于標(biāo)記基因上，用該酶切割后會(huì)破壞標(biāo)記基因，因此不能作為基因的運(yùn)載體，C錯(cuò)誤；
D、該質(zhì)粒含有標(biāo)記基因和限制酶XhoI，但切割位點(diǎn)位于標(biāo)記基因上，用該酶切割后會(huì)破壞標(biāo)記基因，因此不能作為基因的運(yùn)載體，D錯(cuò)誤．
故選：A．
（5）A．限制性核酸內(nèi)切酶具有特異性，一種限制酶只能識(shí)別特點(diǎn)的DNA序列，并在特定的位點(diǎn)進(jìn)行切割，A錯(cuò)誤；
B．限制性核酸內(nèi)切酶的作用是切斷脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵，而RNA聚合酶的作用是在核糖核苷酸之間形成磷酸二酯鍵，B錯(cuò)誤；
C．使用質(zhì)粒運(yùn)載體是為了將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞，避免目的基因被分解，C正確；
D．質(zhì)粒運(yùn)載體可能是由細(xì)菌的DNA改造形成的，但不是由病毒的DNA改造形成的，D錯(cuò)誤．
故選：C．
（6）經(jīng)酶切后的載體和GDNF基因進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物經(jīng)篩選得到的載體主要有三種：單個(gè)載體自連、GDNF基因與載體正向連接、GDNF基因與載體反向連接（如圖1所示）．為鑒定這3種連接方式，選擇HpaI酶和BamHI酶對篩選的載體進(jìn)行雙酶切，若屬于載體自連，且產(chǎn)生的酶切片段只有一種；若是正向連接的重組載體，其產(chǎn)生的酶切片段數(shù)為2個(gè)，且長度分別與質(zhì)粒和GDNF基因長度相同；若是反向連接的重組載體，經(jīng)過BamHⅠ酶切后產(chǎn)生兩種長度的片段，即200bp和6500bp．
故答案為：
（1）限制酶和DNA連接酶    神經(jīng)干細(xì)胞
（2）構(gòu)建基因表達(dá)載體
（3）XhoⅠ
（4）A   
（5）C  
（6）2    ②⑥

點(diǎn)評 本題考查基因工程的相關(guān)知識(shí)，要求考生識(shí)記基因工程的原理、操作工具及操作步驟等，掌握各步驟中的相關(guān)細(xì)節(jié)，能結(jié)合所學(xué)的知識(shí)準(zhǔn)確答題，屬于考綱理解和應(yīng)用層次的考查．