Question

【題目】諾如病毒是一種單鏈RNA 病毒，可引起流行性急性腸胃炎的重要病原體。諾如病毒衣殼P蛋白上含有抗原位點和受體識別位點，在體外可單獨表達，被用于疫苗的免疫實驗研究。

（1）人體感染諾如病毒后，會引發(fā)_______免疫，在康復者血清中能夠檢測到_________（物質(zhì)）。有研究表明感染后第 180 天記憶B細胞仍具有持久性，說明這些細胞對機體具有___________作用。

（2）研究人員希望借P蛋白治療由β蛋白沉積導致的阿爾茨海默癥，選取β蛋白作為免疫原，利用諾如病毒P顆粒作為疫苗載體，研究其免疫原性。研究人員將β蛋白基因插入P蛋白基因的恰當位置，制備了重組P蛋白基因P-β（1780bp）后，采用雙酶切方法，通過NdeⅠ和XhoⅠ酶和pET載體質(zhì)粒（5230bp）構建重組質(zhì)粒pET-P-β，如圖1。對照組應選用___________。

①諾如病毒RNA ②P蛋白基因與pET載體質(zhì)粒構建的重組質(zhì)粒pET-P ③pET載體質(zhì)粒

（3）為了鑒定重組質(zhì)粒pET-P-β是否構建成功，NdeⅠ和XhoⅠ酶分別對重組質(zhì)粒pET-P-β和pET載體質(zhì)粒進行酶切，然后酶切片段和重組P蛋白基因進行電泳，請將你判斷的電泳結果畫到表中對應的泳道上。

7000bp 4000bp 1000bp
DNA標記	P-β	pET	pET-P-β

_______

（4）想要獲得目的蛋白，需要將構建的重組質(zhì)粒pET-P-β、pET-P和pET分別轉(zhuǎn)入用________處理的成為感受態(tài)的大腸桿菌細胞，培養(yǎng)處理后提取蛋白質(zhì)。過程如下：

若干健康小鼠隨機分為3組，將提取的蛋白質(zhì)分別溶于PBS緩沖液，對小鼠進行皮下免疫，并對4次免疫后的血清進行不同梯度稀釋，用__________（β蛋白/P蛋白）作為抗原，通過免疫法檢測重組P-β蛋白的免疫原性。如圖2所示，請據(jù)圖描述出能夠表明P-β蛋白可以在小鼠體內(nèi)引起免疫反應，具有特異的免疫原性的實驗結果____________。

Answer 1

【答案】特異性免疫（體液免疫） 抗體 潛在的長期保護（預防再次感染） ②③ Ca2+（CaCl2） β蛋白 在不同稀釋度條件下，P-β蛋白組的吸光度值均明顯高于PBS組和P蛋白組，PBS組和P蛋白組區(qū)別較小

【解析】

基因工程技術的基本步驟：

（1）目的基因的獲�。悍椒ㄓ袕幕�因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成。

（2）基因表達載體的構建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。

（3）將目的基因?qū)�入受體細胞：根據(jù)受體細胞不同，導入的方法也不一樣。將目的基因?qū)�入植物細胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物細胞的方法是感受態(tài)細胞法。

（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術。個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等。

（1）人體感染諾如病毒后，機體受到抗原的刺激會引發(fā)特異性免疫，在康復患者的血清中產(chǎn)生特異性抗體。記憶細胞能相對持久的識別相同的抗原，避免相同抗原再次入侵對機體的損害，說明記憶細胞對機體具有潛在的長期保護作用。

（2）采用雙酶切法獲得了重組質(zhì)粒pET-P-β，為了研究β蛋白的免疫原性，依據(jù)單一變量的原則，對照組應該是P蛋白基因與pET載體質(zhì)粒構建的重組質(zhì)粒pET-P和pET載體質(zhì)粒，即②③。

（3）根據(jù)題干信息，重組P蛋白基因P-β為1780bp，pET載體質(zhì)粒為5230bp，用NdeⅠ和XhoⅠ酶酶切重組質(zhì)粒pET-P-β能獲得P-β和pET兩個片段，因此p-β酶切電泳后出現(xiàn)一條帶，位置是1780bp，PET酶切電泳后出現(xiàn)一條帶，位置是5230bp、PETp-β酶切后出現(xiàn)兩條帶，位置分別是1780bp和5230bp，具體的圖示結果如下：

（4）將基因表達載體導入大腸桿菌之前，要將大腸桿菌放入一定濃度的CaCl2溶液中處理，使之成為感受態(tài)的細胞。本題欲研究β蛋白的免疫原性，因此免疫后的血清進行不同梯度稀釋后，用β蛋白作為抗原，通過免疫法檢測重組P-β蛋白的免疫原性。據(jù)圖2結果顯示，在不同稀釋度條件下，P-β蛋白組的吸光度值均明顯高于PBS組和P蛋白組，PBS組和P蛋白組區(qū)別較小。