Question

17．GDNF是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，對(duì)損傷的神經(jīng)細(xì)胞具有營養(yǎng)和保護(hù)作用．研究人員構(gòu)建了含GDNF基因的表達(dá)載體（如圖1所示），并導(dǎo)入到大鼠神經(jīng)干細(xì)胞中，用于干細(xì)胞基因治療的研究．請(qǐng)回答：
（1）在分離和培養(yǎng)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的過程中，使細(xì)胞分散開常用的酶是胰蛋白酶或膠原蛋白酶．
（2）構(gòu)建含GDNF基因的表達(dá)載體時(shí)，需選擇圖1中的XhoI限制酶進(jìn)行酶切．
（3）經(jīng)酶切后的載體和GDNF基因進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物經(jīng)篩選得到的載體主要有三種：?jiǎn)蝹�(gè)載體自連、GDNF基因與載體正向連接、GDNF基因與載體反向連接（如圖1所示）．為鑒定這3種連接方式，選擇HpaI酶和BamHI酶對(duì)篩選的載體進(jìn)行雙酶切，并對(duì)酶切后的DNA片段進(jìn)行電泳分析，結(jié)果如圖2所示．圖中第②泳道顯示所鑒定的載體是反向連接的．
（4）將正向連接的表達(dá)載體導(dǎo)入神經(jīng)干細(xì)胞后，為了檢測(cè)GDNF基因是否成功表達(dá)，可用相應(yīng)的抗體與提取的蛋白質(zhì)雜交．當(dāng)培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞達(dá)到一定的密度時(shí)，需進(jìn)行傳代培養(yǎng)以得到更多數(shù)量的細(xì)胞，用于神經(jīng)干細(xì)胞移植治療實(shí)驗(yàn)．

Answer 1

分析 1、基因工程技術(shù)的基本步驟：
（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成．
（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等．
（3）將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣．將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入�?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法．
（4）目的基因的檢測(cè)與鑒定：分子水平上的檢測(cè)：①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)．個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等．
2、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的過程：取動(dòng)物組織塊→剪碎組織→用胰蛋白酶處理分散成單個(gè)細(xì)胞→制成細(xì)胞懸液→轉(zhuǎn)入培養(yǎng)液中（原代培養(yǎng)）→放入二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)→貼滿瓶壁的細(xì)胞用酶分散為單個(gè)細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液→轉(zhuǎn)入培養(yǎng)液（傳代培養(yǎng)）→放入二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)．

解答 解：（1）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，可用胰蛋白酶或膠原蛋白酶作用，使細(xì)胞分散開．
（2）質(zhì)粒上有XhoⅠ識(shí)別位點(diǎn)，而且在啟動(dòng)子之后，所以選用XhoⅠ限制酶進(jìn)行酶切．
（3）泳道①僅有一種條帶，屬于載體自連；泳道②有兩種條帶，且長度分別與質(zhì)粒和GDNF基因長度相同，為正向連接；泳道③有兩種條帶，長度與BamHⅠ酶切后結(jié)果相同，為反向連接．
（4）檢測(cè)基因是否表達(dá)采用抗原抗體雜交法．培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞采用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)法，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到一定程度，需要進(jìn)行分瓶，進(jìn)行傳代培養(yǎng)．
故答案為：
（1）胰蛋白酶或膠原蛋白酶
（2）XhoI
（3）②
（4）抗體   傳代

點(diǎn)評(píng) 本題考查基因工程、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的相關(guān)知識(shí)，要求考生識(shí)記基因工程的原理、操作工具及操作步驟等，掌握各步驟中的相關(guān)細(xì)節(jié)，能結(jié)合所學(xué)的知識(shí)準(zhǔn)確判斷各選項(xiàng)．