Question

【題目】如圖所示為A、B、C三種質(zhì)粒和一個(gè)含目的基因D的DNA片段示意圖。圖中Ap為氨芐青霉素抗性基因，Tc為四環(huán)素抗性基因，lacZ為藍(lán)色顯色基因，EcoRⅠ、PvuⅠ為兩種限制酶，質(zhì)粒上限制酶括號(hào)內(nèi)的數(shù)字表示限制酶切割位點(diǎn)與復(fù)制原點(diǎn)的距離。請(qǐng)回答：

(1)據(jù)圖分析質(zhì)粒A、C一般不能作為運(yùn)載體的理由分別是_________。若要獲取目的基因，應(yīng)該選用________酶切割。

(2)將圖中的目的基因與質(zhì)粒B進(jìn)行重組。在基因工程的操作過(guò)程中，需要檢查目的基因是否重組到質(zhì)粒中，應(yīng)使用_________酶切重組質(zhì)粒，完全酶切后，進(jìn)行電泳檢測(cè)。若電泳圖譜中出現(xiàn)長(zhǎng)度為1.1kb和5.6 kb，或者_________kb和_________kb的片段，則可判斷該重組質(zhì)粒已與目的基因重組成功（重組質(zhì)粒上目的基因的插入位點(diǎn)與EcoRⅠ的識(shí)別位點(diǎn)之間的堿基對(duì)忽略不計(jì)）。

(3)若選擇自身不含lacZ基因并對(duì)抗生素敏感的大腸桿菌作為受體細(xì)胞，則如何篩選成功導(dǎo)入重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞？_________。目的基因能在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出相同的蛋白質(zhì)，其遺傳學(xué)基礎(chǔ)是_________。

Answer 1

【答案】（質(zhì)粒A）缺少標(biāo)記基因、（質(zhì)粒C）復(fù)制原點(diǎn)會(huì)被限制酶切割 PvuI EcoRI 3.1 3.6 在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)經(jīng)過(guò)導(dǎo)入處理的大腸桿菌，若能形成白色菌落的即為導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌 自然界的生物共用一套密碼子

【解析】

分析題圖可知，目的基因只能用PvuⅠ進(jìn)行切割，質(zhì)粒A上有復(fù)制原點(diǎn)以及EcoRⅠ、PvuⅠ兩種限制酶限制酶切位點(diǎn)，無(wú)標(biāo)記基因，不能進(jìn)行目的基因的檢測(cè)；質(zhì)粒B含有EcoRⅠ、PvuⅠ兩種酶切位點(diǎn)、氨芐青霉素抗性基因和藍(lán)色顯色基因，而且相應(yīng)的限制酶切割后，可以保留氨芐青霉素抗性基因的完整性；質(zhì)粒C中含有氨芐青霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因以及EcoRⅠ、PvuⅠ兩種限制酶限制酶切位點(diǎn)，但是PvuⅠ的酶切位點(diǎn)位于復(fù)制原點(diǎn)，目的基因插入會(huì)導(dǎo)致重組質(zhì)粒不能進(jìn)行復(fù)制。

(1)由圖可知，質(zhì)粒A缺乏標(biāo)記基因，質(zhì)粒C中PvuⅠ識(shí)別位點(diǎn)位于復(fù)制原點(diǎn)，故不能選擇質(zhì)粒A、C作為運(yùn)載體。由于EcoRⅠ會(huì)破壞目的基因，目的基因的兩端有PvuⅠ識(shí)別位點(diǎn)，故要獲取目的基因，應(yīng)該選用PvuⅠ酶切割。

(2)將圖中的目的基因與質(zhì)粒B進(jìn)行重組，構(gòu)建基因表達(dá)載體后，要檢查目的基因是否重組到質(zhì)粒中，可以使用EcoRⅠ酶切重組質(zhì)粒，完全酶切后，進(jìn)行電泳檢測(cè)。由于目的基因和載體用一種酶進(jìn)行切割，重組質(zhì)粒（含2個(gè)EcoRⅠ酶位點(diǎn)）會(huì)出現(xiàn)正向連接和反向連接兩種類型，質(zhì)粒B中EcoRⅠ酶切位點(diǎn)與PvuⅠ酶切位點(diǎn)之間的距離為0.1Kb，重組質(zhì)粒中2個(gè)EcoRⅠ酶切點(diǎn)之間的最短距離可能是0.1+1=1.1Kb或0.1+3=3.1Kb，重組質(zhì)粒長(zhǎng)度為：2.7+4=6.7Kb，故EcoRⅠ酶切后，電泳圖譜中出現(xiàn)長(zhǎng)度為1.1kb和5.6kb片段或者3.1kb和3.6kb的片段，說(shuō)明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

(3)由題意可知，重組質(zhì)粒中的lacZ基因會(huì)被破壞，但保留氨芐青霉素抗性基因，故若選擇自身不含lacZ基因并對(duì)抗生素敏感的大腸桿菌作為受體細(xì)胞，可以在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)經(jīng)過(guò)導(dǎo)入處理的大腸桿菌，若能形成白色菌落的即為導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌。由于自然界的生物共用一套密碼子，故目的基因能在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出相同的蛋白質(zhì)。