Question

【題目】圖甲為構(gòu)建重組質(zhì)粒過程中的三種備選質(zhì)粒，其中Ap為氨芐青霉素抗性基因，Tc為四環(huán)素抗性基因。圖乙為培育轉(zhuǎn)AFPs基因(抗凍基因)番茄的示意圖，外源DNA和質(zhì)粒上均標(biāo)出了酶切位點(diǎn)及相關(guān)抗性基因，請(qǐng)回答下列問題。

(1)圖甲中通常選用質(zhì)粒C構(gòu)建重組質(zhì)粒，而不選用質(zhì)粒A或質(zhì)粒B的原因分別是______________________。

(2)據(jù)圖乙分析，若需使用插入滅活法篩選并鑒定重組質(zhì)粒，應(yīng)優(yōu)先選用限制酶________切割目的基因和質(zhì)粒。

(3)通過PCR技術(shù)獲取目的基因時(shí)需設(shè)計(jì)________種引物；從cDNA文庫中獲得的目的基因________(填“含有”或“不含有”)啟動(dòng)子和終止子。

(4)在構(gòu)建基因表達(dá)載體過程中常把兩個(gè)啟動(dòng)子串聯(lián)在一起形成雙啟動(dòng)子，加在目的基因上游。雙啟動(dòng)子的作用可能是________。

(5)圖乙農(nóng)桿菌中的質(zhì)粒應(yīng)含有T－DNA，其作用是________。若要獲得抗凍能力更強(qiáng)的抗凍番茄，可以對(duì)AFPs基因進(jìn)行改造，最終得到相應(yīng)的蛋白質(zhì)，該過程需用到____________工程。

(6)為使改造后的AFPs基因能夠表達(dá)，人工設(shè)計(jì)質(zhì)粒D并對(duì)它的多個(gè)酶切位點(diǎn)進(jìn)行研究。若用HindⅢ酶或KpnⅠ酶單獨(dú)切割質(zhì)粒D，均獲得一條長(zhǎng)鏈，若用HindⅢ酶和EcoRⅠ酶同時(shí)切割，則獲得2個(gè)500bp和1個(gè)2666bp片段，若用KpnⅠ酶和EcoRⅠ酶同時(shí)切割，則獲得2個(gè)250bp和1個(gè)3166bp片段。若以HindⅢ酶切割位點(diǎn)為計(jì)算起點(diǎn)，則KpnⅠ酶切割位點(diǎn)與HindⅢ酶切割位點(diǎn)最短長(zhǎng)度為________，EcoRⅠ酶的兩個(gè)切割位點(diǎn)與HindⅢ切割位點(diǎn)的最短距離為________。

Answer 1

【答案】質(zhì)粒A中沒有標(biāo)記基因，質(zhì)粒B的復(fù)制原點(diǎn)中含有HindⅢ酶切位點(diǎn) BamHⅠ和HindⅢ 2 不含有 保證目的基因的高效轉(zhuǎn)錄(高效表達(dá)) 攜帶目的基因進(jìn)入番茄細(xì)胞并整合到番茄細(xì)胞的染色體DNA 蛋白質(zhì) 750bp 500bp

【解析】

基因工程的操作步驟：目的基因的獲取、構(gòu)建基因表達(dá)載體、把目的基因?qū)�入受體細(xì)胞、目的基因的檢測(cè)和鑒定。

（1）質(zhì)粒A缺乏標(biāo)記基因，質(zhì)粒B的復(fù)制原點(diǎn)中含有限制酶切割位點(diǎn)，可能會(huì)破壞復(fù)制原點(diǎn)，質(zhì)粒C含有多個(gè)標(biāo)記基因和酶切位點(diǎn)，適宜作為基因工程的載體。

（2）圖乙中，選用的質(zhì)粒C作為基因工程的載體，結(jié)合目的基因兩端的酶切位點(diǎn)，目的基因和載體可以選擇BamHⅠ和HindⅢ同時(shí)切割，或者EcoRⅠ和HindⅢ同時(shí)切割，若需使用插入滅活法篩選并鑒定重組質(zhì)粒，應(yīng)優(yōu)先選用限制酶BamHⅠ（會(huì)破壞Tc）和HindⅢ切割，可以根據(jù)是否對(duì)四環(huán)素有抗性來篩選。

（3）啟動(dòng)子是RNA聚合酶結(jié)合的位點(diǎn)，是起始轉(zhuǎn)錄的位點(diǎn)，雙啟動(dòng)子可能是為了高效轉(zhuǎn)錄。

（4）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的Ti質(zhì)粒含有的T-DNA可以攜帶目的基因進(jìn)入番茄細(xì)胞并整合到番茄細(xì)胞的染色體DNA上。對(duì)AFPs基因進(jìn)行改造，進(jìn)而達(dá)到改造獲得抗凍能力更強(qiáng)的抗凍番茄，需要通過蛋白質(zhì)工程實(shí)現(xiàn)。

（5）若用HindⅢ酶或KpnⅠ酶單獨(dú)切割質(zhì)粒D，均獲得一條長(zhǎng)鏈，說明該質(zhì)粒上只含有HindⅢ酶的一個(gè)酶切位點(diǎn)和KpnⅠ酶的一個(gè)酶切位點(diǎn)；若用HindⅢ酶和EcoRⅠ酶同時(shí)切割，則獲得2個(gè)500bp和1個(gè)2666bp片段，若用KpnⅠ酶和EcoRⅠ酶同時(shí)切割，則獲得2個(gè)250bp和1個(gè)3166bp片段。說明EcoRⅠ酶有2個(gè)酶切位點(diǎn)，且兩個(gè)位點(diǎn)之間的最短距離是500bp，而KpnⅠ酶的切點(diǎn)在2個(gè)EcoRⅠ酶切點(diǎn)之間，距離每個(gè)EcoRⅠ酶切點(diǎn)250bp，HindⅢ酶切點(diǎn)距離最近的EcoRⅠ酶切點(diǎn)的最短距離是500bp，距離另一個(gè)EcoRⅠ酶切點(diǎn)的距離是500+500=1000 bp。故KpnⅠ酶切割位點(diǎn)與HindⅢ酶切割位點(diǎn)最短長(zhǎng)度為250+500=750 bp，EcoRⅠ酶的兩個(gè)切割位點(diǎn)與HindⅢ切割位點(diǎn)的最短距離為500bp。