Question

15．為增加油菜種子的含油量，研究人員嘗試將酶D基因與位于葉綠體膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)肽基因相連，導(dǎo)入油菜細(xì)胞并獲得了轉(zhuǎn)基因油菜品種．
（1）研究人員依據(jù)基因的已知序列設(shè)計(jì)引物，采用PCR法從陸地棉基因文庫(kù)中獲取酶D基因，從擬南芥基因文庫(kù)中獲取轉(zhuǎn)運(yùn)肽基因．在上述引物設(shè)計(jì)時(shí)，分別在引物中加入如圖甲所示酶的識(shí)別序列，這樣可以用ClaⅠ（限制酶）和DNA連接酶處理兩個(gè)基因后，得到A、D端（填圖中字母）相連的融合基因．
（2）將上述融合基因插入圖乙所示Ti質(zhì)粒的T-DNA中，構(gòu)建表達(dá)載體；若要把融合基因?qū)�入土壤農(nóng)桿菌，首先必須用Ca²⁺處理土壤農(nóng)桿菌，使土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)變?yōu)楦惺軕B(tài)；然后將重組質(zhì)粒和感受態(tài)細(xì)胞_在緩沖液中混合培養(yǎng)完成轉(zhuǎn)化過程．將獲得的農(nóng)桿菌接種在含四環(huán)素的固體平板上培養(yǎng)得到單菌落，再利用液體培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)，可以得到用于轉(zhuǎn)化的浸染液．
（3）剪取油菜的葉片放入侵染液中一段時(shí)間，此過程的目的是利用農(nóng)桿菌將融合基因?qū)�入油菜�?xì)胞，進(jìn)一步將葉片經(jīng)植物的組織培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因油菜．
（4）提取上述轉(zhuǎn)基因油菜的mRNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下獲得cDNA，再依據(jù)融合基因的DNA片段設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)，可判斷融合基因是否完成轉(zhuǎn)錄．

Answer 1

分析 1、基因文庫(kù)包括cDNA文庫(kù)、基因組文庫(kù)等．某個(gè)群體包含一種生物所有的基因的文庫(kù)叫基因組文庫(kù)，而用某種生物發(fā)育的某個(gè)時(shí)期的mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的多種互補(bǔ)DNA片段屬于cDNA文庫(kù)．
2、限制酶能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開，因此具有專一性．同種限制酶切割能夠產(chǎn)生相同的黏性末端，便于質(zhì)粒和目的基因連接．

解答 解：（1）研究人員依據(jù)基因的已知序列設(shè)計(jì)引物，采用PCR法從陸地棉基因文庫(kù)中獲取酶D基因，從擬南芥基因文庫(kù)中獲取轉(zhuǎn)運(yùn)肽基因．在上述引物設(shè)計(jì)時(shí)，分別在引物中加入如圖甲所示酶的識(shí)別序列，這樣可以用ClaⅠ限制酶和DNA連接酶處理兩個(gè)基因后，得到A、D端相連的融合基因．
（2）將上述融合基因插入圖乙所示Ti質(zhì)粒的T-DNA中，構(gòu)建表達(dá)載體即重組質(zhì)粒，并導(dǎo)入農(nóng)桿菌前，首先必須用Ca²⁺ 處理土壤農(nóng)桿菌，使土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)變?yōu)楦惺軕B(tài)；然后將重組質(zhì)粒和感受態(tài)細(xì)胞在緩沖液中混合培養(yǎng)完成轉(zhuǎn)化過程．將獲得的農(nóng)桿菌接種在含四環(huán)素的固體平板上培養(yǎng)得到單菌落，再利用液體培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)，可以得到用于轉(zhuǎn)化的浸染液．
（3）剪取油菜的葉片放入侵染液中一段時(shí)間，此過程的目的是利用農(nóng)桿菌將融合基因?qū)�入油菜�?xì)胞，進(jìn)一步篩選后通過植物組織培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因油菜．
（4）提取上述轉(zhuǎn)基因油菜的mRNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下獲得cDNA，再依據(jù)融合基因的DNA片段設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)，可判斷融合基因是否完成轉(zhuǎn)錄．
故答案為：
（1）PCR ClaⅠ（限制酶）和DNA連接   A、D
（2）表達(dá)載體（“重組質(zhì)�！保〤a²⁺ 感受 重組質(zhì)粒和感受態(tài)（農(nóng)桿菌）細(xì)胞       四環(huán)素 液體
（3）利用農(nóng)桿菌將融合基因?qū)�入油菜�?xì)胞 植物的組織培養(yǎng)
（4）逆轉(zhuǎn)錄 融合基因 轉(zhuǎn)錄

點(diǎn)評(píng) 本題以增加油菜種子的含油量為材料背景，考查基因工程的相關(guān)知識(shí)，意在考查學(xué)生的識(shí)圖能力和判斷能力，運(yùn)用所學(xué)知識(shí)綜合分析問題和解決問題的能力．