Question

【題目】Period2（Per2）基因是一種抑癌基因，干擾Per2基因表達有利于腫瘤細胞存活和促進腫瘤發(fā)生。p53腫瘤抑制因子是一個關鍵的轉錄因子，調節(jié)DNA修復、細胞周期、衰老凋亡等相關細胞途徑，是抵抗癌癥發(fā)病和進展的重要防御因子，并且是通過與癌蛋白MDM2負調控作用調節(jié)其功能。為探究裸鼠體內下調Per基因對人膠質瘤細胞U343細胞株中P53的可能調控機制，科研人員做了如下實驗：

Ⅰ．裸鼠膠質瘤模型構建

（1）培養(yǎng)U343細胞常在培養(yǎng)基中加入____________，一段時間后用________________消化，制成細胞懸液。

（2）人工合成低表達Per2基因，以某種病毒作為運載體，構建重組DNA，導入到培養(yǎng)好的U343膠質瘤細胞中（實驗組），同時還需要設置2組對照組，分別為：________________（對照組1）、空白對照組（U343）（對照組2）。

（3）每組等量同齡健康裸鼠，皮下相同部位分別對應注入上述組別的U343細胞，適宜條件下培養(yǎng)，定期記錄瘤體體積，記錄到成瘤（體積達1000mm3）的時間，處死小鼠，取出瘤體，提RNA和蛋白質。

II．實驗結果

（4）實驗組小鼠成瘤時間短于兩對照組，且相同時間內實驗組瘤體體積大于兩對照組。

（5）檢測各組U343膠質瘤細胞中Per2 蛋白含量（各組mRNA含量關系同Per2蛋白含量關系），如圖1所示。

注：圖中從左向右依次為實驗組、對照組1、對照組2。

由圖1結果可知，細胞中GAPDH蛋白表達量相對穩(wěn)定，在實驗中可作為參照，作用是____________________________。該實驗結果說明實驗組Per2基因低表達體系構建成功。

（6）已知當DNA損傷后，DNA檢測點基因ATM被激活，隨后誘發(fā)p53激活，而c-myc是原癌基因，p53可與c-myc的啟動子相結合發(fā)生乙�；�反應，已知c-myc的轉錄，相關基因表達后蛋白檢測如圖2（各組mRNA含量關系同蛋白含量關系）

注：圖中從左向右依次為實驗組、對照組1、對照組2。

由圖2可推測，Per2基因的作用為：____________________________________。

III．下調Per基因對人膠質瘤細胞U343細胞株中P53的可能調控機制

（7）綜上，Per2基因低表達可明顯促進膠質瘤的發(fā)生發(fā)展，請你提出一種可能的調控機制：________________________________________________________，導致膠質瘤的發(fā)生和發(fā)展。

Answer 1

【答案】血清（血漿） 胰蛋白酶（膠原蛋白酶） 轉入同種病毒到U343膠質瘤細胞中 排除細胞培養(yǎng)操作、點樣量、檢測方法等對實驗結果的影響 Per2高表達促進p53、ATM表達，抑制c-myc和MDM2表達 Per2基因低表達時，抑制了p53和ATM的表達，促進了MDM2和c-myc的表達，MDM2負調控P53，使p53表達量更低

【解析】

1、通常采用機械消化或胰酶消化動物組織，使其分散為單個細胞。動物細胞的培養(yǎng)：適宜的培養(yǎng)基、添加血清、激素（如胰島素）等。

2、由于生物實驗研究對象存在差異性，大多采用對照實驗法，即確定實驗組后，根據等量原則和單一變量原則設計相應對照組。

Ⅰ．（1）動物細胞的生長除了需要碳源、氮源、無機鹽和水分之外，還需要各種生長因子。因此，培養(yǎng)U343細胞常在培養(yǎng)基中加入血清，為動物細胞提供生長因子。培養(yǎng)一段時間后，可用胰蛋白酶或膠原蛋白酶消化，使細胞分散開制成細胞懸液。

（2）實驗目的：探究裸鼠體內下調Per基因對人膠質瘤細胞U343細胞株中P53的可能調控機制。實驗變量：細胞中是否含有Per基因。實驗設計：①實驗組：人工合成低表達Per2基因，以某種病毒作為運載體，構建重組DNA，導入到培養(yǎng)好的U343膠質瘤細胞中（實驗組）。②對照組1：為了排除病毒對實驗結果的影響，將同種病毒轉入到培養(yǎng)好的U343膠質瘤細胞中。③對照組2：作為空白對照，培養(yǎng)好的U343膠質瘤細胞。

II．（5）由圖1可知，細胞中GAPDH蛋白表達量相對穩(wěn)定，在實驗中可作為參照，可排除細胞培養(yǎng)操作、點樣量、檢測方法等對實驗結果的影響。實驗組U343膠質瘤細胞中Per2 蛋白含量比對照組1和對照組2U343膠質瘤細胞的低，說明Per2基因在實驗組U343膠質瘤細胞中成功表達，即Per2基因低表達體系構建成功。

（6）由圖2可知，細胞中GAPDH蛋白表達量相對穩(wěn)定，可排除細胞培養(yǎng)操作、點樣量、檢測方法等對實驗結果的影響。Per2蛋白含量與p53、ATM的含量成正比，說明Per2高表達促進p53、ATM的表達。Per2蛋白含量與c-myc和MDM2的含量成反比，說明Per2高表達抑制c-myc和MDM2的表達。

III．（7）由（6）的結果可知，Per2基因低表達時，抑制p53、ATM的表達，促進c-myc和MDM2的表達，而MDM2的表達可負調控P53，使p53的表達量更低，導致膠質瘤的發(fā)生和發(fā)展。