Question

4．金屬硫蛋白（MT）是一類廣泛存在的金屬結(jié)合蛋白，某研究小組計(jì)劃通過多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增獲得目的基因，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因工程菌，用于重金屬廢水的凈化處理．PCR擴(kuò)增過程示意圖如圖，請(qǐng)回答下列問題：

（1）從高表達(dá)MT 蛋白的生物組織中提取mRNA，通過逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA用于PCR擴(kuò)增．
（2）設(shè)計(jì)一對(duì)與MT基因兩端序列互補(bǔ)配對(duì)的引物（引物1和引物2），為方便構(gòu)建重組質(zhì)粒，在引物中需要增加適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶位點(diǎn)．設(shè)計(jì)引物時(shí)需要避免引物之間形成堿基互補(bǔ)配對(duì)，而造成引物自連．
（3）圖中步驟1代表變性，步驟2代表退火，步驟3代表延伸，這三個(gè)步驟組成一輪循環(huán)．
（4）PCR擴(kuò)增時(shí)，退火溫度的設(shè)定是成敗的關(guān)鍵．退火溫度過高會(huì)破壞引物與模板的堿基配對(duì)．退火溫度的設(shè)定與引物長(zhǎng)度、堿基組成有關(guān)，長(zhǎng)度相同但GC含量高的引物需要設(shè)定更高的退火溫度．
（5）如果PCR反應(yīng)得不到任何擴(kuò)增產(chǎn)物，則可以采取的改進(jìn)措施有②③（填序號(hào)：①升高退火溫度②降低退火溫度③重新設(shè)計(jì)引物）．

Answer 1

分析 PCR技術(shù)：
1、概念：PCR全稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA的核酸合成技術(shù)．
2、原理：DNA復(fù)制．
3、前提條件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一對(duì)引物．
4、條件：模板DNA、四種脫氧核苷酸、一對(duì)引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）．
5、過程：①高溫變性：DNA解旋過程；②低溫復(fù)性：引物結(jié)合到互補(bǔ)鏈DNA上；③中溫延伸：合成子鏈．PCR擴(kuò)增中雙鏈DNA解開不需要解旋酶，高溫條件下氫鍵可自動(dòng)解開．

解答 解：（1）PCR擴(kuò)增目的基因，首先要有目的基因作為模板，所以從高表達(dá)MT 蛋白的生物組織中提取mRNA，通過逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，從而用于PCR擴(kuò)增．
（2）構(gòu)建重組質(zhì)粒，首先要用限制酶切割含目的基因的DNA片段和質(zhì)粒，所以位于目的基因兩端的引物中需要增加適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶位點(diǎn)．設(shè)計(jì)的引物之間不能有堿基互補(bǔ)配對(duì)，否則引物自連，而不能與模板相連．
（3）圖中步驟1、2、3分別代表變性、退火、延伸，這三個(gè)步驟組成一輪循環(huán)．
（4）退火表示引物與模板相連，若退火溫度過高會(huì)破壞引物與模板的堿基配對(duì)．由于G-C之間有三個(gè)氫鍵，A-T之間有兩個(gè)氫鍵，所以G-C含量越高的引物，退火溫度越高．
（5）PCR反應(yīng)得不到任何擴(kuò)增產(chǎn)物，可能是退火溫度過高，導(dǎo)致引物與模板不能相連；或引物間相互配對(duì)，引物自連，不能與模板相連．因此，可通過降低退火溫度或重新設(shè)計(jì)引物進(jìn)行改進(jìn)．
故答案為：
（1）逆轉(zhuǎn)錄    cDNA
（2）限制性核酸內(nèi)切酶         堿基互補(bǔ)配對(duì)
（3）變性
（4）引物與模板     GC含量高
（5）②③

點(diǎn)評(píng) 本題主要考查基因工程的相關(guān)知識(shí)，要求學(xué)生理解PCR的具體過程，以及引物的作用，學(xué)會(huì)分析引物或溫度改變對(duì)PCR結(jié)果的影響．