Question

【題目】金屬硫蛋白（MT）是一類廣泛存在的金屬結(jié)合蛋白，某研究小組計(jì) 劃通過(guò)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增獲得目的基因，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因工程菌，用于重金屬?gòu)U水的凈 化處理。PCR 擴(kuò)增過(guò)程示意圖如圖，請(qǐng)回答下列問題：

（1）從高表達(dá) MT 蛋白的生物組織中提取 mRNA，通過(guò)_____獲得_____用于 PCR 擴(kuò)增。

（2）設(shè)計(jì)一對(duì)與 MT 基因兩端序列互補(bǔ)配對(duì)的引物（引物 1 和引物 2），為方便構(gòu)建重組質(zhì)粒， 在引物中需要增加適當(dāng)?shù)?/span> _____ 位點(diǎn)。設(shè)計(jì)引物時(shí)需要避免引物之間_____，而造成引物自連。

（3）PCR 擴(kuò)增時(shí)，退火溫度的設(shè)定是成敗的關(guān)鍵。退火溫度過(guò)高會(huì)破壞_____的堿基配對(duì)。退 火溫度的設(shè)定與引物長(zhǎng)度、堿基組成有關(guān)，長(zhǎng)度相同但_____的引物需要設(shè)定更高的退火溫度。

（4）如果 PCR 反應(yīng)得不到任何擴(kuò)增產(chǎn)物，則可以采取的改進(jìn)措施有_____（填序號(hào)：①升高退 火溫度②降低退火溫度③重新設(shè)計(jì)引物）。

（5）圖中步驟 1 代表_____，步驟 2 代表退火，步驟 3 代表延伸。

Answer 1

【答案】逆轉(zhuǎn)錄 cDNA 限制性核酸內(nèi)切酶 堿基互補(bǔ)配對(duì) 引物與模板 GC含量高 ②③ 變性

【解析】

PCR技術(shù)：
1、概念：PCR全稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA的核酸合成技術(shù)。

2、原理：DNA復(fù)制。

3、前提條件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一對(duì)引物。

4、條件：模板DNA、四種脫氧核苷酸、一對(duì)引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）。

5、過(guò)程：①高溫變性：DNA解旋過(guò)程；②低溫復(fù)性：引物結(jié)合到互補(bǔ)鏈DNA上；③中溫延伸：合成子鏈，PCR擴(kuò)增中雙鏈DNA解開不需要解旋酶，高溫條件下氫鍵可自動(dòng)解開。

（1）PCR擴(kuò)增目的基因，首先要有目的基因作為模板，所以從高表達(dá)MT蛋白的生物組織中提取mRNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，從而用于PCR擴(kuò)增。

（2）構(gòu)建重組質(zhì)粒，首先要用限制酶切割含目的基因的DNA片段和質(zhì)粒，所以位于目的基因兩端的引物中需要增加適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶位點(diǎn)．設(shè)計(jì)的引物之間不能有堿基互補(bǔ)配對(duì)，否則引物自連，而不能與模板相連。

（3）退火表示引物與模板相連，若退火溫度過(guò)高會(huì)破壞引物與模板的堿基配對(duì)．由于G-C之間有三個(gè)氫鍵，A-T之間有兩個(gè)氫鍵，所以G-C含量越高的引物，退火溫度越高。

（4）PCR反應(yīng)得不到任何擴(kuò)增產(chǎn)物，可能是退火溫度過(guò)高，導(dǎo)致引物與模板不能相連；或引物間相互配對(duì)，引物自連，不能與模板相連，因此，可通過(guò)降低退火溫度或重新設(shè)計(jì)引物進(jìn)行改進(jìn)，故選②③。

（5）圖中步驟1、2、3分別代表變性、退火、延伸，這三個(gè)步驟組成一輪循環(huán)。