Question

發(fā)光細(xì)菌檢測法在檢測生物毒性的方法中具有靈敏、簡便的特點(diǎn)而被廣泛采用．
實(shí)驗(yàn)原理：細(xì)菌代謝正常時，發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度穩(wěn)定，并可維持較長時間；當(dāng)外界環(huán)境影響到發(fā)光細(xì)菌代謝時，發(fā)光會立即受到抑制，且抑制程度與影響物質(zhì)濃度大小呈相關(guān)關(guān)系．
實(shí)驗(yàn)材料：明亮發(fā)光桿菌（海水細(xì)菌）、待測海水水樣、2%的NaCl溶液、3%NaCl溶液、生物毒性測試儀（用于測定細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度）、全溫振蕩器、試管等．
Ⅰ．發(fā)光細(xì)菌的培養(yǎng)
發(fā)光細(xì)菌可以直接從海水中和海魚的體表和內(nèi)臟中分離，所采用的培養(yǎng)基成分為：胰蛋白胨0.5%，酵母膏0.5%，甘油0.3%，KH₂PO₄0.1%，Na₂HPO₄0.5%，NaCI₃%，瓊脂2%，pH6.5．
（1）發(fā)光細(xì)菌為

 

（自養(yǎng)型/異養(yǎng)型）．取海魚內(nèi)臟放入滅菌培養(yǎng)皿中20℃培養(yǎng)12-18小時，在暗室中尋找發(fā)光點(diǎn)，用

 

刮取少許菌苔，在

 

培養(yǎng)基中采用

 

法獲得純化的發(fā)光菌株．使用前接種到

 

培養(yǎng)基中20℃下振蕩培養(yǎng)10-12小時，增殖后用磷酸緩沖液稀釋后備用．
Ⅱ．海水中重金屬污染程度測定
a、配制發(fā)光菌懸液；
b、抑光反應(yīng)：按照下表配置海水樣品稀釋液；
表1海水中重金屬污染程度測定

試管編號	1	2	3	4	5
3%NaCl溶液（mL）		4.74	4.49	4.24	3.99
海水樣品（mL）		0.25	0.50	0.75	1.00
發(fā)光菌懸液（mL）		0.01	0.01	0.01	0.01
混合液中海水濃度（%）		0.05	0.10	0.15	0.20

（2）表1中1號試管的作用是

 

．
（3）請?jiān)诒砀裰刑顚戇m當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)．
（4）利用生物毒性測試儀測定各試管的

 

（測定指標(biāo)）．
Ⅲ．五氯酚鈉毒性測定
資料：五氯酚鈉在水中以五氯苯酚陰離子和五氯苯酚分子平衡存在；五氯苯酚比五氯酚鈉的極性小得多，更容易通過生物膜而與細(xì)菌細(xì)胞相接觸．實(shí)驗(yàn)溫度25℃下，pH為6.0、7.0、8.0、9.0時，pH每升高1個單位，分子態(tài)五氯苯酚所占的比例就下降一個數(shù)量級．
a、將五氯酚鈉配成5個左右濃度等級，將接種后12h的菌液1-2mL用20-30mL3%NaCl溶液稀釋混合，磁力攪拌10min 后，?取0.2mL加入比色管中，上下振蕩5次，去塞，靜置15min后用生物毒性測試儀測定發(fā)光強(qiáng)度．
b、計(jì)算相對發(fā)光率
相對發(fā)光率（RL）=測試管發(fā)光量mV/對照管發(fā)光量mV×100%
計(jì)算對應(yīng)相對發(fā)光率減小50%的物質(zhì)濃度（EC50）??
c．不同pH條件下，五氯酚鈉毒性測定
發(fā)光細(xì)菌適宜生存的pH值為6.0-9.0
?表2    不同pΗ 值下五氯酚鈉毒性測定結(jié)果/㎎?L^-1

pΗ	6.0	7.0	8.0	9.0
EC50值	1.74	2.41	9.39	15.94

（5）表2的結(jié)果與結(jié)論

 

．
（6）據(jù)資料分析可能的原因：

 

．

Answer 1

考點(diǎn)：微生物的利用,培養(yǎng)基對微生物的選擇作用

專題：

分析：據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)可知，表1中1號試管應(yīng)為對照組，起對照作用．根據(jù)對照原則和等量原則，1號試管中應(yīng)不加入海水樣品，且保持試管中液體相等，故應(yīng)加入4.99mL3%NaCl溶液及0.01mL發(fā)光菌懸液．本實(shí)驗(yàn)測定指標(biāo)可用利用發(fā)光率來表示，故可用生物毒性測試儀測定各試管的發(fā)光強(qiáng)度．根據(jù)表2的結(jié)果可知發(fā)光細(xì)菌在 pH值6.0-9.0間，EC50值隨著pΗ值的提高而增大，故說明五氯酚鈉對發(fā)光細(xì)菌的毒性降低．

解答： 解：（1）發(fā)光細(xì)菌的代謝方式為異養(yǎng)型，接種時可用接種環(huán)接種到固體培養(yǎng)基上，通過平板劃線法獲得純化的菌株；然后利用液體培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)．
（2）據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)可知，表1中1號試管應(yīng)為對照組，起對照作用．
（3）根據(jù)對照原則和等量原則，1號試管中應(yīng)不加入海水樣品，且保持試管中液體相等，故應(yīng)加入4.99mL3%NaCl溶液及0.01mL發(fā)光菌懸液．
（4）本實(shí)驗(yàn)測定指標(biāo)可用利用發(fā)光率來表示，故可用生物毒性測試儀測定各試管的發(fā)光強(qiáng)度．
（5）根據(jù)表2的結(jié)果可知發(fā)光細(xì)菌在 pH值6.0-9.0間，EC50值隨著pΗ值的提高而增大，故說明五氯酚鈉對發(fā)光細(xì)菌的毒性降低．
（6）據(jù)資料分析可能的原因?yàn)槲迓缺椒右淄ㄟ^細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)菌，對細(xì)菌造成毒性．發(fā)光細(xì)菌在pH值6.0-9.0間，隨著pH升高，分子態(tài)五氯苯酚所占的比例就下降，進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞的數(shù)量減少，因而毒性下降．
故答案為：（1）異養(yǎng)型    接種環(huán)    固體    劃線法    液體
（2）對照
（3）

試管編號	1
3%NaCl溶液（mL）	4.99
海水樣品（mL）	0
發(fā)光菌懸液（mL）	0.01
混合液中海水濃度（%）	0

（4）發(fā)光強(qiáng)度
（5）發(fā)光細(xì)菌在 pH值6.0-9.0間，EC50值隨著pΗ值的提高而增大，五氯酚鈉對發(fā)光細(xì)菌的毒性降低．?
（6）五氯苯酚易通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)菌，對細(xì)菌造成毒性．發(fā)光細(xì)菌在 pH值6.0-9.0間，隨著pH升高，分子態(tài)五氯苯酚所占的比例就下降，進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞的數(shù)量減少，因而毒性下降．

點(diǎn)評：本題綜合考查了微生物的培養(yǎng)、應(yīng)用和實(shí)驗(yàn)探究，意在考查學(xué)生的應(yīng)用和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)能力，試題難度中等．