Question

【題目】黑胸大蠊是一種生活在我國南方地區(qū)的主要衛(wèi)生害蟲，通過生物防治手段可以起到一定抑制蟲害的作用。某研究小組對黑胸大蠊?jié)夂瞬《镜腜fDNV基因與pUCl19質(zhì)粒進(jìn)行重組構(gòu)建，通過感染黑胸大蠊研究其病理特征，已知KpnⅠ、PstⅠ、HindⅢ3種限制酶的酶切位點(diǎn)不同，Amp為氨芐青霉素抗性基因，實(shí)驗(yàn)過程圖解如下。請分析回答下列問題：

（1）純化后的PfDNV基因可通過___________技術(shù)擴(kuò)增。常將PfDNV基因與pUC119 質(zhì)粒采取加G—C尾的連接方式構(gòu)建重組質(zhì)粒，該加尾的連接方式能使重組質(zhì)粒的熱穩(wěn)定性___________。

（2）研究小組將獲得的重組質(zhì)粒通過___________法轉(zhuǎn)染大腸桿菌，在含有___________的培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時間后，挑選出部分菌株，用HindⅢ酶解菌株中的重組質(zhì)粒，經(jīng)電泳分析后發(fā)現(xiàn)有些菌株顯示有5kb和3.7kb片段，還有些菌株顯示有1.8kb和6.9kb片段，出現(xiàn)這種情況的原因是______________________。

（3）選擇可以正常表達(dá)的重組質(zhì)粒PfDNV-pUCl19，利用KpnⅠ酶酶解后回收7.3kb的片段，通過_______的作用獲得PfΔKpn-pUC119重組質(zhì)粒，將兩種重組質(zhì)粒通過腹部注射法注入黑胸大蠊幼蟲體內(nèi)，所得的結(jié)果如下表所示。

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染黑胸大蠊實(shí)驗(yàn)結(jié)果

接種物	接種蟲數(shù)	感染蟲數(shù)	感染百分?jǐn)?shù)（%）
PfΔKpn-pUC119
（2500ng）	20	20	100
（1250ng）	20	1S	90
（250ng）	20	17	85
PfAKpn-pUC119
（2300ng）	20	0	0
（1000ng）	20	0	0
野生型病毒	20	20	100
未接種	20	0	0

從上表中可以看出，當(dāng)注射的重組質(zhì)粒PfDNV-pUCl19的量在___________ng及以上時，蟲體最終死亡率與野生型病毒感染的結(jié)果—致。PfΔKpn-pUC119重組質(zhì)粒注射幼蟲后沒有感染的根本原因是：KpnⅠ酶酶解后再連接，導(dǎo)致______________________。

Answer 1

【答案】 PCR 提高 感受態(tài)轉(zhuǎn)化（冰凍的氣化鈣溶液處理） 氨芐青霉素 基因和質(zhì)粒的正向和反向連接 DNA連接酶 2500 PfDNV基因缺失了部分片段

【解析】試題分析：本題綜合考查學(xué)生對基因工程的知識的識記和理解能力。解答本題需熟記并理解基因工程的基本操作程序并形成清晰的知識網(wǎng)絡(luò)。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合問題情境，從題圖和題意中提取有效信息，進(jìn)行相關(guān)問題的解答。

(1)純化后的PfDNV基因可通過PCR技術(shù)擴(kuò)增。常將PfDNV基因與pUC119 質(zhì)粒采取加G—C尾的連接方式構(gòu)建重組質(zhì)粒，可使該“重組質(zhì)粒”中的G—C堿基比例增加。DNA分子含有的氫鍵數(shù)越多，其結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，在每個DNA分子中，堿基對A與T之間有2個氫鍵，C與G之間有3個氫鍵，所以該加尾的連接方式能使重組質(zhì)粒的熱穩(wěn)定性提高。

(2)研究小組將獲得的重組質(zhì)粒通過感受態(tài)轉(zhuǎn)化（冰凍的氯化鈣溶液處理）法轉(zhuǎn)染大腸桿菌。重組質(zhì)粒含有的Amp為氨芐青霉素抗性基因，使其對氨芐青霉素有抗性。在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時間后，可將成功導(dǎo)入目的基因的菌株挑選出來。HindⅢ酶解菌株中的重組質(zhì)粒，經(jīng)電泳分析后發(fā)現(xiàn)有些菌株顯示有5kb和3.7kb片段，還有些菌株顯示有1.8kb和6.9kb片段，結(jié)合圖示分析可推知：出現(xiàn)這種情況的原因是基因和質(zhì)粒的正向和反向連接。

(3)通過DNA連接酶可將KpnⅠ酶解后回收的7.3kb的片段連接，進(jìn)而獲得PfΔKpn-pUC119重組質(zhì)粒。分析表中信息可知：當(dāng)注射的重組質(zhì)粒PfDNV-pUCl19的量在2500 ng及以上時，蟲體最終死亡率與野生型病毒感染的結(jié)果—致。PfΔKpn-pUC119重組質(zhì)粒注射幼蟲后沒有感染的根本原因是：KpnⅠ酶解后再連接，導(dǎo)致PfDNV基因缺失了部分片段。