Question

【題目】為了提高馬鈴薯對真菌病害的抗性，某科研小組進行了馬鈴薯轉(zhuǎn)基因抗病育種的初步研究，其過程如下所示，請將其完善：

（1）從生防木霉菌株中提取總RNA以及通過____________過程合成cDNA。

（2）利用PCR技術(shù)對目的基因Chi（抗菌基因）進行擴增：PCR產(chǎn)物與PMDTM18-T載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，獲得重組質(zhì)粒PMDTM18-T-Chi。

（3）植物表達載體的構(gòu)建（如圖所示）：將重組質(zhì)粒PMDTM18-T-Chi和p33ECR質(zhì)粒用____________（填具體酶）進行酶切，再用T4 DNA連接酶連接，得到p33ECR-Chi。此過程中一般會使用高濃度的TDNA連接酶，T4 DNA連接酶的作用是______________________。表達載體中p35S是___________（填序號）識別和結(jié)合的部位。

①DNA聚合酶 ②DNA連接酶

③限制酶 ④RNA聚合酶

（4）p33ECR-Chi工程菌的獲得：將p33ECR-Chi質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌菌株中，在含_____________的培養(yǎng)基上獲得白色菌斑，挑菌落，獲得工程菌。

（5）轉(zhuǎn)基因植株的獲得：通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將Chi基因轉(zhuǎn)化到馬鈴薯栽培品種試管馬鈴薯的塊莖中。試管馬鈴薯的塊莖是馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化的理想外植體，分析其具有的優(yōu)點是_________________（填序號）

①周期長 ②取材方便 ③無需滅菌 ④轉(zhuǎn)化效率高

（6）對馬鈴薯進行抗菌檢測：從分子水平上可采用_____________法檢測目的基因表達的產(chǎn)物；從個體水平上進行檢測的操作是_______________________。

Answer 1

【答案】逆轉(zhuǎn)錄 BamHI和SacI 既可以“縫合”雙鏈DNA片段互補的黏性末端，又可以“縫合”雙鏈DNA片段的平末端 ④ 氨芐青霉素 ②③④ 抗原一抗體雜交 霉菌接種實驗

【解析】

基因工程的基本操作步驟主要包括四步：①目的基因的獲��；②基因表達載體的構(gòu)建；③將目的基因?qū)�入受體細胞；④目的基因的檢測與鑒定。

（1）cDNA是以mRNA為模板，通過反（逆）轉(zhuǎn)錄過程合成的。

（3）構(gòu)建基因表達載體時，一般用限制酶對目的基因和載體進行切割，目的基因應插入啟動子之后，由圖中所示的表達載體組成可以看出，該表達載體構(gòu)建時所用的限制酶為BamHI和SacI；T4 DNA連接酶的作用是：既可以“縫合”雙鏈DNA片段互補的黏性末端，又可以“縫合”雙鏈DNA片段的平末端；p35S是啟動子，是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位。

（4）由圖示基因表達載體可以看出，p33ECR-Chi的標記基因為氨芐青霉素抗性基因，因此在篩選該轉(zhuǎn)化菌株時，應將p33ECR-Chi質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌的菌株，培養(yǎng)在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上進行篩選。

（5）試管馬鈴薯的塊莖因其取材方便、無需滅菌、轉(zhuǎn)化效率高等優(yōu)點，是馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化的理想外植體。

（6）對馬鈴薯進行抗菌檢測：從分子水平上可采用抗原——抗體雜交法檢測目的基因表達的產(chǎn)物；從個體水平上可采用霉菌接種實驗進行檢測。