Question

【題目】金屬硫蛋白(MT)是一類廣泛存在的金屬結(jié)合蛋白，某研究小組計(jì)劃通過(guò)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增獲得目的基因，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因工程菌，用于重金屬?gòu)U水的凈化處理。PCR擴(kuò)增過(guò)程示意圖如下，請(qǐng)回答下列問(wèn)題：

（1）從高表達(dá)MT 蛋白的生物組織中提取mRNA，通過(guò)___________獲得___________用于PCR擴(kuò)增。

（2）設(shè)計(jì)一對(duì)與MT基因兩端序列互補(bǔ)配對(duì)的引物(引物1和引物2)，為方便構(gòu)建重組質(zhì)粒，在引物中需要增加適當(dāng)?shù)?/span>____________位點(diǎn)。設(shè)計(jì)引物時(shí)需要避免引物之間形成____________，而造成引物自連。

（3）圖中步驟1代表變性，步驟2代表退火，步驟3代表延伸，這三個(gè)步驟組成一輪循環(huán)。PCR擴(kuò)增時(shí)，退火溫度的設(shè)定是成敗的關(guān)鍵。退火溫度過(guò)高會(huì)破壞____________的堿基配對(duì)。

（4）如果PCR反應(yīng)得不到任何擴(kuò)增產(chǎn)物，則可以采取的改進(jìn)措施有____________ （填序號(hào)：①升高退火溫度 ②降低退火溫度 ③重新設(shè)計(jì)引物）。

Answer 1

【答案】逆轉(zhuǎn)錄 cDNA 限制性核酸內(nèi)切酶 堿基互補(bǔ)配對(duì) 引物與模板 ②③

【解析】

PCR技術(shù)：

1、概念：PCR全稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA的核酸合成技術(shù)；

2、原理：DNA復(fù)制；

3、前提條件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一對(duì)引物；

4、條件：模板DNA、四種脫氧核苷酸、一對(duì)引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）；

5、過(guò)程：①高溫變性：DNA解旋過(guò)程；②低溫復(fù)性：引物結(jié)合到互補(bǔ)鏈DNA上；③中溫延伸：合成子鏈．PCR擴(kuò)增中雙鏈DNA解開不需要解旋酶，高溫條件下氫鍵可自動(dòng)解開。

（1）PCR擴(kuò)增目的基因，首先要有目的基因作為模板，所以從高表達(dá)MT 蛋白的生物組織中提取mRNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，從而用于PCR擴(kuò)增。

（2）構(gòu)建重組質(zhì)粒，首先要用限制酶切割含目的基因的DNA片段和質(zhì)粒，所以位于目的基因兩端的引物中需要增加適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶位點(diǎn)。設(shè)計(jì)的引物之間不能有堿基互補(bǔ)配對(duì)，否則引物自連，而不能與模板相連。

（3）退火表示引物與模板相連，若退火溫度過(guò)高會(huì)破壞引物與模板的堿基配對(duì)。

（4）PCR反應(yīng)得不到任何擴(kuò)增產(chǎn)物，可能是退火溫度過(guò)高，導(dǎo)致引物與模板不能相連；或引物間相互配對(duì)，引物自連，不能與模板相連。因此，可通過(guò)降低退火溫度或重新設(shè)計(jì)引物進(jìn)行改進(jìn)。