Question

13．某一質(zhì)粒載體如圖1所示，若將 HSA 基因插入到 Ampr 或 Tetr 中會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的基因失活（Ampr 表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr 表示四環(huán)素抗性基因）．有人將此質(zhì)粒載體用 BamHI 酶切后，與用 BamHI 酶切獲得的目的基因混合，加入 DNA 連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，用得到的混合物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，結(jié)果大腸桿菌有的未被轉(zhuǎn)化，有的被轉(zhuǎn)化．被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質(zhì)粒載體、含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌．回答下列問題：

（1）質(zhì)粒載體作為基因工程的工具，應(yīng)具備的基本條件有能夠自我復(fù)制、具有標(biāo)記基因、具有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)（答出兩點(diǎn)即可）．而作為基因表達(dá)載體，除滿足上述基本條件外，還需具有啟動(dòng)子和終止子．若 采用 PCR 技術(shù)擴(kuò)增 HSA 基因，圖2中箭頭表示一條引物結(jié)合模板的位置及擴(kuò)增方向，請(qǐng)用箭頭在方框內(nèi)標(biāo)出標(biāo)出另 一條引物的位置及擴(kuò)增方向．
（2）如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，在上述四種大腸桿菌細(xì)胞中，未被轉(zhuǎn)化的和僅含有環(huán)狀目的基因的細(xì)胞是不能區(qū)分的，其原因是二者均不含氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上都不能生長；并且含有質(zhì)粒載體和含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的細(xì)胞也是不能區(qū)分的，其原因是二者都含氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均能生長．在上述篩選的基礎(chǔ)上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌的單菌落，還需使用含有四環(huán)素的固體培養(yǎng)基．
（3）將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌時(shí)需用Ca²⁺處理大腸桿菌使之成為感受態(tài)．

Answer 1

分析 1、“分子運(yùn)輸車”--載體
（1）載體具備的條件：①能在受體細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存．
②具有一至多個(gè)限制酶切點(diǎn)，供外源DNA片段插入．
③具有標(biāo)記基因，供重組DNA的鑒定和選擇．
（2）最常用的載體是質(zhì)粒，它是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單的、獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外，并具有自我復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀DNA分子．
（3）其它載體：噬菌體的衍生物、動(dòng)植物病毒．
2、將目的基因?qū)�入微生物�?xì)胞：原核生物作為受體細(xì)胞的原因是 繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)較少，最常用的原核細(xì)胞是 大腸桿菌，其轉(zhuǎn)化方法是：先用 Ca²⁺處理細(xì)胞，使其成為  感受態(tài)細(xì)胞，再將 重組表達(dá)載體DNA分子溶于緩沖液中與感受態(tài)細(xì)胞混合，在一定的溫度下促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子，完成轉(zhuǎn)化過程．

解答 解：（1）載體具備的條件：①能在受體細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存．②具有一至多個(gè)限制酶切點(diǎn)，供外源DNA片段插入．③具有標(biāo)記基因，供重組DNA的鑒定和選擇．作為基因表達(dá)載體，除滿足上述基本條件外，還需具有啟動(dòng)子和終止子．若采用PCR 技術(shù)擴(kuò)增 HSA 基因，基因的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械�，因此兩條鏈擴(kuò)增的方向也是相反的，如圖所示：．

（2）由于未被轉(zhuǎn)化的和僅含有環(huán)狀目的基因的大腸桿菌中不含有氨芐青霉素抗性基因，因此如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，未被轉(zhuǎn)化的和僅含有環(huán)狀目的基因的大腸桿菌均不能存活，因此兩者是不能區(qū)分的；含有質(zhì)粒的大腸桿菌和含重組質(zhì)粒的大腸桿菌的細(xì)胞由于均含有氨芐青霉素抗性基因，在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上都能生長，因此兩者也是不能區(qū)分的．在上述篩選的基礎(chǔ)上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌的單菌落，還需使用含有四環(huán)素的固體培養(yǎng)基，即含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌在其中不能生長，而含有普通質(zhì)粒的大腸桿菌能生長．
（3）受體細(xì)胞是微生物時(shí)，需要用Ca²⁺溶液處理大腸桿菌使之成為感受態(tài)．
故答案為：
（1）能夠自我復(fù)制、具有標(biāo)記基因、具有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)    終止子    
（2）二者均不含氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上都不能生長      含有質(zhì)粒載體         含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒（或答含有重組質(zhì) 粒）        二者都含氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均能生長       四環(huán)素
（3）Ca²⁺

點(diǎn)評(píng) 本題考查了基因工程的有關(guān)知識(shí)，要求考生能夠識(shí)記質(zhì)粒作為運(yùn)載體的條件，掌握目的基因檢測(cè)和鑒定的方法，再結(jié)合題干信息準(zhǔn)確分析．