Question

【題目】基因打靶技術(shù)是建立在基因同源重組技術(shù)以及胚胎干細胞技術(shù)的基礎(chǔ)上而發(fā)展起來的一種分子生物學技術(shù)。結(jié)合圖示回答問題。

注:neor是新霉素抗性基因;tk基因的表達可以使無毒的丙氧鳥苷代謝為毒性物質(zhì),導(dǎo)致細胞死亡。

(1)將目的基因和與細胞內(nèi)靶基因同源的DNA片段都重組到_______上,構(gòu)建打靶載體(基因表達載體)。

(2)打靶載體測序驗證正確后,利用____酶,將之線性化,以提高重組率。通過________技術(shù)導(dǎo)入胚胎干細胞,這樣打靶載體與細胞內(nèi)靶基因同源的區(qū)段就有幾率發(fā)生同源重組。

(3)為了篩選發(fā)生同源重組的細胞,可在培養(yǎng)液中加入_____________。最后還需要通過__________技術(shù)鑒定同源重組的細胞(去除靶基因),將這樣的細胞通過________培養(yǎng)后,獲得大量打靶成功的細胞。其中,暫時不用的細胞進行液氮(或冷凍)保存。

(4)將打靶成功的細胞注射入小鼠囊胚,移植到同種、_________________的母鼠體內(nèi),一段時間后對受體母鼠進行____檢查,確保其生下嵌合小鼠。這種嵌合體小鼠長大后,體內(nèi)同時存在被“修飾”過的基因和未被“修飾”的基因。如果某些小鼠的______(選填“體細胞”或“生殖細胞”)恰巧被“修飾”過了,則它們的雜交后代中,就可能出現(xiàn)基因完全被“修飾”過的小鼠。

Answer 1

【答案】（1）載體（或質(zhì)粒）（1分）

（2）限制 （2分） 顯微注射（2分）

（3）新霉素和丙氧鳥苷（2分） DNA分子雜交（2分 ） 動物細胞（或克隆）（2分 ）

（4）生理狀態(tài)相同（或經(jīng)同期發(fā)情）（2分） 妊娠（1分） 生殖細胞（1分）

【解析】（1）構(gòu)建打靶載體（基因表達載體），需要將目的基因和與細胞內(nèi)靶基因同源的DNA 片段都重組到載體（或質(zhì)粒）上。

（2）將環(huán)狀的打靶載體線性化，需利用限制酶進行切割，通過顯微注射技術(shù)將其導(dǎo)入胚胎干細胞。

（3）在同源重組時，tk基因?qū)⒈磺谐�而丟失，但新霉素抗性基因得以保留且結(jié)構(gòu)完整，所以為了篩選發(fā)生同源重組的細胞，可在培養(yǎng)液中加入新霉素和丙氧鳥苷。鑒定去除靶基因的同源重組的細胞，可通過DNA分子雜交技術(shù)。將這樣的細胞通過動物細胞培養(yǎng)后，獲得大量打靶成功的細胞。

（4）胚胎移植時，需將含有打靶成功細胞的囊胚移植到同種、生理狀態(tài)相同（或經(jīng)同期發(fā)情）的母鼠體內(nèi)，一段時間后對受體母鼠進行妊娠檢查，確保其生下嵌合小鼠。生殖細胞參與新個體的形成過程，如果某些小鼠的生殖細胞恰巧被“修飾”過了，則它們的雜交后代中，就可能出現(xiàn)基因完全被“修飾”過的小鼠。