Question

18．融合蛋白是通過DNA重組技術(shù)將兩個(gè)或多個(gè)基因的編碼區(qū)首尾連接，由同一調(diào)控序列控制合成的蛋白質(zhì)．人的表皮生長因子受體（EGFR）是影響癌癥發(fā)生發(fā)展的重要因素，它在肺癌、腦腫瘤等實(shí)體瘤中均有大量表達(dá)．天花粉蛋白（TCS）是重要天花粉的有效成分，具有抗腫瘤作用．下圖是通過基因工程方法將人表皮生長因子基因（EGF）和TCS基因連接起來，利用大腸桿菌生成人表皮生長因子-天花粉蛋白融合蛋白的過程示意圖．請(qǐng)回答：

（1）為了建立含有EGF的cDNA文庫，應(yīng)從健康人體的表皮細(xì)胞中提取總mRNA，通過反（逆）轉(zhuǎn)錄法合成cDNA．從cDNA文庫中提取的EGF的長度比從基因組文庫中提取的EGF短．利用PCR技術(shù)可以大量擴(kuò)增EGF，該技術(shù)所利用的原理是DNA雙鏈復(fù)制．
（2）在①過程中，應(yīng)使用的限制酶是BamHⅠ和SphⅠ，在融合蛋白基因的首端還應(yīng)
插入啟動(dòng)子，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的位點(diǎn)．
（3）在②過程中，首先用Ca²⁺處理大腸桿菌，使其轉(zhuǎn)變?yōu)楦惺軕B(tài)細(xì)胞．
（4）應(yīng)用抗原--抗體雜交_技術(shù)可檢測(cè)大腸桿菌是否表達(dá)出融合蛋白．
（5）單純使用天花粉蛋白治療癌癥療效甚微，而人表皮生長因子--天花粉蛋白融合蛋白療效顯著，其原因是人表皮生長因子能與腫瘤細(xì)胞表面的受體（EGFR）特異性結(jié)合，從而使天花粉蛋白定向的作用于腫瘤細(xì)胞．
（6）某同學(xué)為了篩選插入目的基因的表達(dá)載體，將處理過的載體分別置于含有氨芐青霉素和四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察其增殖和表達(dá)情況．此設(shè)計(jì)方案是否合理，不合理請(qǐng)說明理由表達(dá)載體不能在培養(yǎng)基上增殖和表達(dá)，只有導(dǎo)入大腸桿菌，才能增殖和表達(dá)．

Answer 1

分析 分析題圖：圖示是將人表皮生長因子基因（EGF）和TCS基因連接起來，利用大腸桿菌生產(chǎn)人表皮生長因子--天花粉蛋白融合蛋白的過程示意圖．圖中①表示基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程；②表示將重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程．

解答 解：（1）EGF基因只在表皮細(xì)胞中表達(dá)，即只有表皮細(xì)胞中含有相應(yīng)的mRNA，因此要獲得EGF基因，應(yīng)從健康人體的表皮細(xì)胞中提取其mRNA，通過逆轉(zhuǎn)錄法合成．通過逆轉(zhuǎn)錄法合成的EGF基因不含內(nèi)含子、啟動(dòng)子等結(jié)構(gòu)，因此其長度比從基因組文庫中獲取的EGF基因短．利用PCR技術(shù)可以大量擴(kuò)增EGF，該技術(shù)所利用的原理是DNA雙鏈復(fù)制．
（2）EGF基因兩側(cè)的限制酶是BamHI和Sph I，因此在①過程中，應(yīng)使用的限制酶是BamHI和SphI，而且在融合蛋白基因的首端還應(yīng)插入啟動(dòng)子．
（3）在②過程中，首先用Ca²⁺處理大腸桿菌，使其轉(zhuǎn)變?yōu)楦惺軕B(tài)細(xì)胞．
（4）應(yīng)用抗原--抗體雜交_技術(shù)可檢測(cè)大腸桿菌是否表達(dá)出融合蛋白．
（5）人表皮生長因子能與腫瘤細(xì)胞表面的受體特異性結(jié)合，從而使天花粉蛋白定向地作用于腫瘤細(xì)胞，因此單純使用天花粉蛋白治療癌癥療效甚微，而人表皮生長因子--天花粉蛋白融合蛋白療效顯著．
（6）由于表達(dá)載體不能在培養(yǎng)基上增殖和表達(dá)，只有導(dǎo)入大腸桿菌，才能增殖和表達(dá)，因此不能采用該方案．
故答案為：
（1）表皮    反（逆）轉(zhuǎn)錄    短   PCR     DNA雙鏈復(fù)制
（2）BamHⅠ和SphⅠ啟動(dòng)子       RNA聚合酶
（3）Ca²⁺      感受態(tài)
（4）抗原--抗體雜交     
（5）人表皮生長因子能與腫瘤細(xì)胞表面的受體（EGFR）特異性結(jié)合，從而使天花粉蛋白定向的作用于腫瘤細(xì)胞
（6）不合理     表達(dá)載體不能在培養(yǎng)基上增殖和表達(dá)，只有導(dǎo)入大腸桿菌，才能增殖和表達(dá)

點(diǎn)評(píng) 本題結(jié)合利用大腸桿菌生產(chǎn)人表皮生長因子--天花粉蛋白融合蛋白的過程示意圖，考查基因工程的相關(guān)知識(shí)，要求考生識(shí)記基因工程的操作工具和操作步驟，掌握基因工程原理的應(yīng)用，能正確分析題圖，同時(shí)能結(jié)合圖中信息準(zhǔn)確答題．