Question

多聚半乳糖醛酸酶（PG），能降解果膠使細(xì)胞壁破損．番茄果實(shí)成熟中，PG合成顯著增加，能使果實(shí)交紅變軟，但不利于保鮮，可利用基因工程的方法以其進(jìn)行改造．請(qǐng)據(jù)圖1回答：

（1）提取目的基因
①若已獲取PG的mRNA，可通過

 

獲取PG基因．
②在該基因上游加結(jié)構(gòu)A可確保基因的反義轉(zhuǎn)錄，結(jié)構(gòu)A上應(yīng)具有

 

酶結(jié)合位點(diǎn)．得到的目的基因兩側(cè)需人工合成BamHI黏性末端．已知BamHⅠ的識(shí)別序列如圖2-甲所示，請(qǐng)?jiān)趫D2-乙相應(yīng)位置上，畫出目的基因兩側(cè)的黏性末端

 

．
③重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中的目的是

 

．
（2）用含目的基因的農(nóng)稈菌感染番茄原生質(zhì)體后，可用培養(yǎng)基進(jìn)行篩選．培養(yǎng)24-48h后取樣，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的蔗糖溶液中，觀察細(xì)胞

 

現(xiàn)象來鑒別細(xì)胞壁是否再生．
（3）由于導(dǎo)入的目的基因能轉(zhuǎn)錄反義RNA，且能與

 

互補(bǔ)結(jié)合，抑制PG基因的正常表達(dá)．若轉(zhuǎn)基因番茄的保質(zhì)期比非轉(zhuǎn)基因番茄

 

，則可確定轉(zhuǎn)基因番茄成功．
（4）獲得的轉(zhuǎn)基因番茄產(chǎn)生的種子不一定保留目的基因，科研人員常采用

 

技術(shù)手段使子代保持轉(zhuǎn)基因的優(yōu)良性狀．
（5）改造過程需要的工具酶有

 

，如果在此過程中形成的是平末端，則起“縫合作用的酶是

 

．
（6）在構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，除了插入目的基因外，基因表達(dá)載體中還需含有

 

，在該番茄薪品種的培育過程中，將目的基因?qū)�入受體細(xì)胞的方法叫做

 

．

Answer 1

考點(diǎn)：基因工程的原理及技術(shù)

專題：

分析：分析流程圖：圖示表示轉(zhuǎn)基因番茄的培育過程，在PG基因上游加結(jié)構(gòu)A以確�；�因的反向轉(zhuǎn)錄，再構(gòu)建基因表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，將目的基因?qū)�入番茄原生質(zhì)體，培養(yǎng)使之再生出細(xì)胞壁，再用植物組織培養(yǎng)技術(shù)使子代保持轉(zhuǎn)基因的優(yōu)良性狀．

解答： 解：（1）①已獲取PG的mRNA，可通過逆轉(zhuǎn)錄或cDNA文庫的方法獲得目的基因．
②基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物是mRNA，在轉(zhuǎn)錄時(shí)需要RNA聚合酶．目的基因兩側(cè)的黏性末端如圖：

③大腸桿菌繁殖快，因此將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中的目的是大量復(fù)制目的基因（克隆目的基因）．
（2）植物細(xì)胞在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的蔗糖溶液中會(huì)發(fā)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象，這可以用來鑒別細(xì)胞壁是否再生．
（3）反義RNA一般是指與編碼鏈或有義鏈互補(bǔ)的DNA鏈編碼的RNA，mRNA是由編碼鏈或有義鏈編碼的RNA，所以反義RNA和mRNA分子能互補(bǔ)成雙鏈的RNA．由于核糖體不能翻譯雙鏈的RNA，所以反義RNA與mRNA特異性的互補(bǔ)結(jié)合，即抑制了該mRNA的翻譯；若轉(zhuǎn)基因番茄的保質(zhì)期比非轉(zhuǎn)基因番茄長，則可確定轉(zhuǎn)基因番茄成功．
（4）獲得的轉(zhuǎn)基因番茄產(chǎn)生的種子（是有性生殖的后代，會(huì)發(fā)生性狀分離）不一定保留目的基因，故要保持該優(yōu)良性狀，可采用無性生殖即植物組織培養(yǎng)的方法．
（5）改造過程需要的工具酶有限制酶和DNA連接酶；DNA連接酶分為E．coliDNA連接酶和T₄DNA連接酶，這二者都能連接黏性末端，此外T₄DNA連接酶還可以連接平末端．
（6）基因表達(dá)載體的組成包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因、復(fù)制原點(diǎn)；將目的基因?qū)�入植物�?xì)胞常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法．
故答案為：
（1）①逆轉(zhuǎn)錄（或cDNA文庫）
②RNA聚合酶       
③大量復(fù)制目的基因（克隆目的基因）
（2）是否發(fā)生質(zhì)壁分離
（3）天然PG基因轉(zhuǎn)錄的mRNA      長
（4）植物組織培養(yǎng)
（5）限制酶和DNA連接酶    T₄DNA連接酶
（6）啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因、復(fù)制原點(diǎn)     農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

點(diǎn)評(píng)：本題結(jié)合轉(zhuǎn)基因番茄形成的流程圖，考查基因工程、植物組織培養(yǎng)等知識(shí)，要求考生掌基因工程的原理和具體操作步驟，認(rèn)真分析轉(zhuǎn)基因番茄形成的流程圖，理解轉(zhuǎn)基因番茄的保質(zhì)期時(shí)間長的原因，再答題．需要注意的是第（3）題，還要求考生明確質(zhì)壁分離的應(yīng)用，可以用于判斷植物細(xì)胞是否再生出細(xì)胞壁．