Question

19．如圖是我國利用基因工程方法生產人生長激素的示意圖．圖中的質粒是基因工程中常選用的栽體一pBR322質粒，amp^R表示青霉素抗性基因，tet^R表示四環(huán)素抗性基因，限制酶PstI、EcosRI和HindX切割形成的末端均不相同．據圖回答下列問題：
（1）為了使目的基因和質粒定向連接并且有利于受體細胞的篩選，③過程采用的酶是PstI酶和EcoRI酶，④過程采用的酶是DNA連接酶，它作用的化學鍵為磷酸二酯鍵．
（2）為了提高⑤過程的成功率，常用CaCl₂溶液處理大腸桿菌．作為受體的大腸桿菌細胞內，應不含青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因，以利于篩選出含重組質粒的受體菌．
（3）如果用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ同時對質粒進行切割，假設同時只有任意兩個位點被切斷且每次機會相等，則形成的DNA片段有6種，其中含有完整四環(huán)素抗性基因的DNA片段占$\frac{1}{6}$．
（4）按照圖示的操作，將三角瓶中的大腸桿菌先接種到甲培養(yǎng)基上，然后分別接種到乙和丙兩個培養(yǎng)基的相同位置，一段時間后，菌落的生長狀況如圖所示．接種到甲培養(yǎng)基上的目的是篩選含四環(huán)素抗性基因的大腸桿菌．
（5）能否利用人的皮膚細胞來完成①過程不能，原因是人的皮膚細胞內存在生長激素基因，但由于基因的選擇性表達，人的皮膚細胞內不能合成生長激素mRNA．

Answer 1

分析 根據圖示可知，含有重組質粒的大腸桿菌能在四環(huán)素培養(yǎng)基中生存，但不能在青霉素培養(yǎng)基中生存，可知切割質粒時應選用的酶是限制酶PstI，破壞了青霉素抗性基因．甲、丙培養(yǎng)基中含有四環(huán)素，因此能在甲和丙中生長的大腸桿菌含有四環(huán)素抗性基因，包括導入普通質粒和重組質粒的大腸桿菌；乙培養(yǎng)基中含有四環(huán)素和青霉素，因此能在乙中生長的是導入普通質粒的大腸桿菌．與丙相比，乙培養(yǎng)基中少了兩個菌落，說明丙培養(yǎng)基中這兩個菌落中的大腸桿菌成功導入了重組質粒．

解答 解：（1）由分析可知，破壞的是青霉素抗性基因，所以用限制酶PstI，而且要保證目的基因和質粒定向連接，所以不能形成相同的黏性末端，故另一種酶選EcoRI酶，將目的基因與運載體連接需要DNA連接酶，它作用的化學鍵為磷酸二酯鍵．
（2）將目的基因導入微生物細胞，常用CaCl₂ 處理，使之成為感受態(tài)細胞．由于質粒中含有青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因，所以受體細胞大腸桿菌中不應含有這兩種基因，以便于用篩選．
（3）用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ進行切割，只有任意兩個位點被切斷且每次機會相等，任意兩種酶切割會形成2個DNA片段，所以切割三次共有6個片段且這些片段不等，既得到6種．只有同時用PstI酶和FcoRI酶切割時會得到一個完整四環(huán)素抗性基因的DNA片段，故概率為$\frac{1}{6}$．
（4）甲培養(yǎng)基中含有四環(huán)素，所以培養(yǎng)的是獲得含有四環(huán)素抗性基因的大腸桿菌．
（5）人的皮膚細胞內存在生長激素基因，但由于基因的選擇性表達，人的皮膚細胞內不能合成生長激素mRNA，所以不能用人的皮膚細胞完成①過程．
故答案為：
（1）Pst I酶和EcoR I酶  DNA連接酶    磷酸二酯鍵
（2）CaCl₂    青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性
（3）6   $\frac{1}{6}$
（4）含四環(huán)素抗性基因
（5）不能     人的皮膚細胞內存在生長激素基因，但由于基因的選擇性表達，人的皮膚細胞內不能合成生長激素mRNA

點評 本題考查了基因工程和微生物培養(yǎng)的相關知識，考生要能夠通過菌落培養(yǎng)的情況確定重組質粒中破壞的抗性基因，進而確定使用的限制酶，要求考生具有一定的析圖能力和理解判斷能力，難度適中．