Question

4．科學(xué)家將人的生長激素基因與大腸桿菌的DNA分子進行重組，并成功地在大腸桿菌中得以表達．但在進行基因工程的操作過程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，便于重組和篩選．已知限制酶Ⅰ的識別序列和切點是-G↓GATCC-，限制酶Ⅱ的識別序列和切點是-↓GATC-，據(jù)圖回答：

（1）過程①表示的是采取反轉(zhuǎn)錄（人工合成）的方法來獲取目的基因，為了擴增目的基因，常常采用PCR方法達到目的，其前提是要有一段已知的有一段已知的核苷酸序列．
（2）根據(jù)圖示分析，在構(gòu)建基因表達載體過程中，應(yīng)用限制酶Ⅰ切割質(zhì)粒以便于篩選，用限制酶Ⅱ切割目的基因．用限制酶切割目的基因和運載體后形成的黏性末端通過堿基互補配對原則進行連接．
（3）將重組質(zhì)粒導(dǎo)入細菌B時采用的方法是用用CaCl₂處理細菌細胞獲得感受態(tài)細胞處理，人體的生長激素基因能在細菌體內(nèi)成功表達是因為共用一套密碼子，寫出目的基因在細菌B中表達的過程．
（4）將得到的大腸桿菌B涂布在一個含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上，能夠生長，說明大腸桿菌B已導(dǎo)入了普通質(zhì)粒或重組質(zhì)粒，反之則沒有導(dǎo)入．接著采用分子雜交技術(shù)鑒定目的基因是否成功轉(zhuǎn)錄，采用抗原抗體雜交技術(shù)鑒定目的基因是否成功表達．

Answer 1

分析 基因工程技術(shù)的基本步驟：
（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴增和人工合成．
（2）基因表達載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等．
（3）將目的基因?qū)�入受體細胞：根據(jù)受體細胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣．將目的基因?qū)�入植物細胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)�入動物細胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)�入微生物細胞的方法是感受態(tài)細胞法．
（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因--DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA--分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)--抗原-抗體雜交技術(shù)．個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等．

解答 解：（1）過程①是以mRNA為模板形成基因的過程，屬于反轉(zhuǎn)錄，此過程需要逆轉(zhuǎn)錄酶的參與．為了擴增目的基因，常采用PCR技術(shù)擴增，其前提是要有一段已知的有一段已知的核苷酸序列，以便合成引物．
（2）在構(gòu)建基因表達載體時，需用限制酶對目的基因和質(zhì)粒進行切割以形成相同的黏性末端．質(zhì)粒如果用限制酶Ⅱ來切割的話，將會在質(zhì)粒在出現(xiàn)兩個切口且抗生素抗性基因全被破壞，故質(zhì)粒只能用限制酶Ⅰ切割（破壞四環(huán)素抗性而保留氨芐青霉素抗性，即將來形成的重組質(zhì)粒能在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生存，而在含四環(huán)素的培養(yǎng)基中不能生存）；目的基因兩端都出現(xiàn)黏性末端時才能和質(zhì)粒發(fā)生重組，故目的基因只有用限制酶Ⅱ切割時，才會在兩端都出現(xiàn)黏性末端．黏性末端其實是被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，這個切口上帶有幾個伸出的核苷酸，它們之間正好通過堿基互補配對進行連接．
（3）將重組質(zhì)粒導(dǎo)入細菌B時需要用CaCl₂處理細菌細胞，以獲得感受態(tài)細胞．所有的生物都共用一套密碼子，所以人體的生長激素基因能在細菌體內(nèi)成功表達，過程是生長激素基因→mRNA→生長激素．
（4）因本題上有2個標記基因，但抗四環(huán)素基因被插入的目的基因破壞掉，因此剩下的是抗氨芐青霉素抗性基因，如果在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上能生長，說明已經(jīng)導(dǎo)入了重組質(zhì)�；蚱胀ㄙ|(zhì)粒A，因為普通質(zhì)粒和重組質(zhì)粒都含有抗氨芐青霉素的基因．目的基因的檢測和鑒定過程中，一般采用分子雜交技術(shù)鑒定目的基因是否成功轉(zhuǎn)錄，采用抗原抗體雜交技術(shù)鑒定目的基因是否成功表達．
故答案為：
（1）反轉(zhuǎn)錄（人工合成）   PCR   有一段已知的核苷酸序列
（2）ⅠⅡ堿基互補配對
（3）用CaCl₂處理細菌細胞獲得感受態(tài)細胞      共用一套密碼子

（4）普通質(zhì)�；蛑亟M質(zhì)粒        分子雜交技術(shù)      抗原抗體雜交技術(shù)

點評 本題考查基因工程的相關(guān)知識，要求考生識記基因工程的原理、操作工具及操作步驟，掌握各操作步驟中需要注意的細節(jié)問題，能結(jié)合所學(xué)的知識準確答題．