Question

Rag₂基因缺失小鼠因不能產(chǎn)生Rag₂蛋白，導(dǎo)致其不能產(chǎn)生成熟的淋巴細(xì)胞．科研人員利用胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）對(duì)Rag₂基因缺失小鼠進(jìn)行基因治療．其技術(shù)流程如圖：

（1）步驟①中，在核移植前應(yīng)去除卵母細(xì)胞的

 

（結(jié)構(gòu)）．
（2）培養(yǎng)細(xì)胞過(guò)程中，要置于CO₂培養(yǎng)箱中，中CO₂的主要作用是

 

，與培養(yǎng)植物細(xì)胞相比，培養(yǎng)基中特有的成分是

 

．
（3）步驟③中，需要構(gòu)建含有Rag₂基因的表達(dá)載體．可以根據(jù)Rag₂基因的

 

設(shè)計(jì)引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增Rag₂基因片段．用HindⅢ和PstⅠ限制酶分別在片段兩側(cè)進(jìn)行酶切獲得Rag₂基因片段．為將該片段直接連接到表達(dá)載體，所選擇的表達(dá)載體上應(yīng)具有

 

酶的酶切位點(diǎn)．將構(gòu)建好的基因表達(dá)載體導(dǎo)入ES細(xì)胞的方法是

 

（4）為檢測(cè)Rag₂基因的表達(dá)情況，可提取治療后小鼠骨髓細(xì)胞的蛋白質(zhì)，用抗

 

的抗體進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)．

Answer 1

考點(diǎn)：胚胎干細(xì)胞的來(lái)源及分化,動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)過(guò)程

專(zhuān)題：

分析：
分析圖1：①表示核移植過(guò)程；②表示早期胚胎培養(yǎng)過(guò)程；③表示將目的基因?qū)�入ES細(xì)胞．
分析圖2：該DNA片段含有四種限制酶識(shí)別序列和切割位點(diǎn)，其中SamⅠ酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)位于目的基因上．
分析圖3：圖3為質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖，該質(zhì)粒含有2個(gè)標(biāo)記基因（紅色熒光標(biāo)記基因和綠色熒光標(biāo)記基因）．

解答： 解：（1）核移植是將體細(xì)胞核移植到去核的卵母細(xì)胞中，所以實(shí)驗(yàn)前要去除卵母細(xì)胞的細(xì)胞核．
（2）培養(yǎng)細(xì)胞過(guò)程中，要置于CO₂培養(yǎng)箱中，CO₂的主要作用是調(diào)節(jié)培養(yǎng)液PH，與培養(yǎng)植物細(xì)胞相比，培養(yǎng)基中特有的成分是動(dòng)物血清．
（3）步驟③是將目的基因?qū)�入ES細(xì)胞，該過(guò)程之前需要構(gòu)建基因表達(dá)載體；DNA復(fù)制只能從5’到3’，因此構(gòu)建前利用PCR技術(shù)擴(kuò)增干擾素基因時(shí)，可以從圖2中A、B、C、D四種單鏈DNA片段中選取B和C作為引物．由圖可知，SamⅠ酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)位于目的基因上，用該酶切割會(huì)破壞目的基因，因此對(duì)干擾素基因片段和質(zhì)粒進(jìn)行酶切時(shí)，可選用限制酶HindⅢ和PstⅠ或EcoRⅠ和PstⅠ．將構(gòu)建好的基因表達(dá)載體導(dǎo)入ES細(xì)胞的方法是顯微注射法．
（4）為檢測(cè)Rag₂基因是否表達(dá)，可以采用抗原-抗體（Rag₂蛋白）雜交法．
故答案為：
（1）細(xì)胞核  
（2）調(diào)節(jié)培養(yǎng)液PH  動(dòng)物血清  
（3）核苷酸序列   HindⅢ和PstⅠ限制酶    
（4）Rag₂蛋白

點(diǎn)評(píng)：本題以基因治療的流程圖為載體，考查了基因工程、細(xì)胞工程以及胚胎工程等方面的知識(shí)，難度適中．考生要能夠識(shí)記細(xì)胞核移植的過(guò)程；識(shí)記囊胚包括內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層兩部分；明確基因工程中質(zhì)粒和目的基因需要利用同種限制酶進(jìn)行切割；掌握目的基因檢測(cè)和鑒定的一般方法等．