Question

6．如表是幾種限制酶識別序列及其切割位點，圖1、圖2中標注了相關限制酶的酶切位點，其中切割位點相同的而不重復標注．請回答下列問題．

限制酶	BamHⅠ	BclⅠ	Sau3AⅠ	HindⅢ
識別序列及切割位點

（1）用圖中質粒和目的基因構建重組質粒，應選用限制酶為BclⅠ和HindⅢ，酶切后的載體和目的基因片段通過DNA連接酶作用后獲得重組質粒．
（2）若BamHⅠ酶切的DNA末端與BclⅠ酶切的DNA末端可直接被DNA連接酶連接，原因是黏性末端相同，這兩種酶都不能（選填“都能”“都不能”或“只有一種能”）切開連接的部位，原因是核苷酸序列不能被BclⅠ和HindⅢ識別切割．
（3）若用Sau3AⅠ切圖1質粒最多可能獲得7種大小不同的DNA片段．
（4）為了篩選出轉入了重組質粒的大腸桿菌，應在篩選平板培養(yǎng)基中添加四環(huán)素，平板上長出的菌落，常用PCR鑒定，所用的引物組成為圖2中引物甲和引物丙．

Answer 1

分析 解答本題的關鍵在于理解重組質粒中標記基因的作用．選擇限制酶需注意插入目的基因時不能破壞標記基因．PCR擴增基因時，兩種引物結合的部位相反，延伸的方向相反．限制酶具有特異性，不同的限制酶識別不同的序列，判斷某種限制酶能否切割片斷，應該據(jù)該片段中是否含有限制酶的識別序列．
根據(jù)題意和圖示分析可知：在質粒上存在BamH I、BclⅠ、BamH I和HindⅢ等四個酶切位點，其中BamH I的切割位點在兩個抗性基因上都有，而抗性基因為載體的標記基因，因此不可用該酶切割．在目的基因上，BclⅠ、BamH I、HindⅢ和Sau3AⅠ四種酶也存在酶切位點．

解答 解：（1）選擇的限制酶應在目的基因兩端存在識別位點，但BamHⅠ可能使質粒中的啟動子丟失，且會破壞質粒中的兩個抗性基因；Sau3A I在質粒上有三個酶切位點，也會破壞質粒中的兩個抗性基因，不利于后期的篩選，所以應選用限制酶為BclⅠ和HindⅢ．選擇的限制酶應在目的基因兩側切割，切割后的DNA片段用DNA連接酶連接．
（2）BamHⅠ酶切得DNA末端與BclⅠ酶切得DNA末端可直接被DNA連接酶連接，原因是黏性末端相同（即同尾酶），但是被DNA連接酶連接后便不能再被這兩種限制酶切割了，因為不滿足兩種限制酶對識別序列的特異性要求．
（3）根據(jù)BamHⅠ、BclI和Sau3A I的酶切位點，Sau3A I在質粒上有三個酶切位點，完全酶切可得到記為A、B、C三種片段，若部分位點被切開，可得到AB、AC、BC、ABC四種片段，所以用Sau3A I切圖1質粒最多可能獲得7種大小不同的DNA片段．
（4）為了篩選出轉入了重組質粒的大腸桿菌，應在篩選平板培養(yǎng)基中添加四環(huán)素（根據(jù)標記基因的種類），平板上長出的菌落，常用PCR鑒定，所用的引物應具有成對反向的特點．
故答案為：
（1）BclⅠ和HindⅢDNA連接
（2）黏性末端相同    都不能    核苷酸序列不能被BclⅠ和HindⅢ識別切割
（3）7
（4）四環(huán)素    引物甲和引物丙

點評 本題考查基因工程的相關知識，要求考生識記基因工程的原理及操作步驟，掌握各操作步驟的相關細節(jié)，能結合所學的知識準確答題，屬于考綱應用和理解層次的考查．