Question

8．許多大腸桿菌的質(zhì)粒上含有l(wèi)acZ′基因（內(nèi)含EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)），其編碼的產(chǎn)物β-半乳糖苷酶在X-gal 和IPTG存在下，可以產(chǎn)生藍(lán)色沉淀，使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，否則菌落呈現(xiàn)白色．基因工程中常利用該原理從導(dǎo)入質(zhì)粒的受體細(xì)胞中篩選出真正導(dǎo)入重組質(zhì)粒的細(xì)胞，過程如圖所示．請(qǐng)據(jù)圖回答：

（1）限制酶EcoRⅠ的識(shí)別序列和酶切位點(diǎn)是-G↓AATTC-，SmaⅠ的識(shí)別序列和酶切位點(diǎn)是-CCC↓GGG-．圖中目的基因被切割下來和質(zhì)粒連接之前，需在目的基因的右側(cè)連接相應(yīng)的末端，連接的末端序列是-TTAA．
（2）在構(gòu)建基因表達(dá)載體的過程中，除了目的基因外，還必須有啟動(dòng)子和終止子、復(fù)制原點(diǎn)和標(biāo)記基因等．
（3）菌落①②③中顏色為白色的是③，原因是lacZ′標(biāo)記基因區(qū)插入外源基因后被破壞，不能表達(dá)出半乳糖苷酶，故菌落為白色．
（4）菌落中的目的基因是否表達(dá)，可采用抗原一抗體雜交技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)．

Answer 1

分析 分析題圖：目的基因的左側(cè)有限制酶EcoRI的識(shí)別序列，右側(cè)是限制酶SmaI的識(shí)別序列，而質(zhì)粒上只有限制酶EcoRI的識(shí)別序列，所以需要用限制酶EcoRI來切割質(zhì)粒，用限制酶EcoRI和SmaI來切割含有目的基因的外源DNA分子，這樣就使目的基因右側(cè)無法與質(zhì)粒連接，所以目的基因被切割下來和質(zhì)粒連接之前，需在目的基因的右側(cè)連接限制酶EcoRI切割形成的末端，即-TTAA．用限制酶EcoRI切割質(zhì)粒時(shí)，會(huì)破壞質(zhì)粒上的lacZ'基因，但切割后的質(zhì)粒自身環(huán)化后，lacZ'基因又被修復(fù)，能表達(dá)產(chǎn)生B-半乳糖苷酶，在X-gal和IPTG 存在下，可以產(chǎn)生藍(lán)色沉淀，使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，所以菌落①②呈現(xiàn)藍(lán)色；菌落③導(dǎo)入的是重組質(zhì)粒，其lacZ'基因被破壞，不能表達(dá)產(chǎn)生B-半乳糖苷酶，在X-gal和IPTG 存在下，菌落顏色為白色．

解答 解：（1）由圖可知，目的基因的左側(cè)有限制酶EcoRI的識(shí)別序列，右側(cè)是限制酶Sma I的識(shí)別序列，而質(zhì)粒上只有限制酶EcoRI的識(shí)別序列，所以需要用限制酶EcoRI來切割質(zhì)粒，用限制酶EcoRI和Sma I來切割含有目的基因的外源DNA分子，這樣就使目的基因右側(cè)無法與質(zhì)粒連接，所以目的基因被切割下來和質(zhì)粒連接之前，需在目的基因的右側(cè)連接限制酶EcoRI切割形成的末端，即-TTAA．
（2）基因表達(dá)載體的組成包括啟動(dòng)子、目的基因、標(biāo)記基因和終止子．
（3）用限制酶EcoRI切割質(zhì)粒時(shí)，會(huì)破壞質(zhì)粒上的lacZ'基因，但切割后的質(zhì)粒自身環(huán)化后，lacZ'基因又被修復(fù)，能表達(dá)產(chǎn)生B-半乳糖苷酶，在X-gal和IPTG 存在下，可以產(chǎn)生藍(lán)色沉淀，使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，所以菌落①②呈現(xiàn)藍(lán)色；菌落③導(dǎo)入的是重組質(zhì)粒，其lacZ'基因被破壞，不能表達(dá)產(chǎn)生B-半乳糖苷酶，在X-gal和IPTG 存在下，菌落顏色為白色．
（4）檢測(cè)目的基因是否表達(dá)產(chǎn)生蛋白質(zhì)，可采用抗原一抗體雜交法．
故答案為：
（1）-TTAA
（2）啟動(dòng)子和終止子
（3）③lacZ′標(biāo)記基因區(qū)插入外源基因后被破壞，不能表達(dá)出半乳糖苷酶，故菌落為白色
（4）抗原一抗體雜交

點(diǎn)評(píng) 本題結(jié)合圖解，考查基因工程的相關(guān)知識(shí)，要求考生識(shí)記基因工程的原理、操作工具及操作步驟，掌握各操作步驟中需要注意的細(xì)節(jié)，能緊扣題干信息“l(fā)acZ′基因編碼的產(chǎn)物β-半乳糖苷酶在X-gal 和IPTG存在下，可以產(chǎn)生藍(lán)色沉淀，使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，否則菌落呈現(xiàn)白色”準(zhǔn)確答題，屬于考綱識(shí)記和理解層次的考查．