Question

19．小立碗蘚是一種苔蘚植物，易培養(yǎng)，被廣泛應用于生物學實驗研究，又因其同源重組的效率很高，已成為研究基因功能的良好材料．請回答下列問題：
（1）甲同學在使用高倍鏡觀察小立碗蘚的葉綠體時，發(fā)現(xiàn)在適宜條件下細胞中的葉綠體長時間靜止不動，最可能的原因是細胞已死亡．
（2）乙同學用小立碗蘚進行了如下實驗操作：
步驟一：在潔凈的載玻片中央加一滴清水，放置一片小立碗蘚的小葉，蓋上蓋玻片．
步驟二：從蓋玻片一側(cè)滴入0.3g/mL的蔗糖溶液，在蓋玻片的另一側(cè)用吸水紙吸引，這樣重復幾次．
步驟三：在顯微鏡下觀察，若發(fā)現(xiàn)葉綠體向細胞中間聚攏，說明細胞已發(fā)生質(zhì)壁分離．
（3）同源重組在細胞中可自然發(fā)生，交叉互換的位點必須發(fā)生在特定的同源序列中，原理如圖1所示．已知由硫酸鹽降解酶（K基因編碼）催化某種硫酸鹽（APS）的降解是高等植物中硫酸鹽利用的關鍵步驟．有人提出，植物體中還存在著該硫酸鹽降解的支路（PAPS），但不能確定其相關酶是否在植物體中存在．科研人員利用小立碗蘚進行了以下研究：
①測定K基因兩側(cè)的堿基序列．若測得在序列“5′…CGACCCGGGAGT…3′”中含有一個6個堿基對的限制酶SmaⅠ的識別序列，可推知該酶的識別序列為CCCGGG．
②質(zhì)粒pcDNA3上有Neo基因（新霉素抗性基因）和限制酶SmaⅠ、TthⅢ和BsmⅠ的酶切位點，如圖2所示．為了使Neo基因能與K基因發(fā)生同源重組，應選用限制酶SmaⅠ和BsmⅠ將Neo基因從質(zhì)粒上切下來，然后在該基因的兩側(cè)增加與K基因兩側(cè)相同的同源序列，構(gòu)建具有Neo基因的表達載體．
③制備小立碗蘚的原生質(zhì)體，將其放在等滲溶液中，利用聚乙二醇介導直接將Neo基因表達載體導入小立碗蘚細胞內(nèi)．
④在添加了新霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述小立碗蘚細胞，若能夠發(fā)育成完整的植物體，則表明該植株已沒有K基因．若通過此轉(zhuǎn)化途徑得到的植株可利用硫酸鹽作為唯一硫源，說明在小立碗蘚中存在PAPS支路．

Answer 1

分析 分析題意可知，觀察質(zhì)壁分離時，需用活細胞，用引流法替換為蔗糖溶液后，可觀察到質(zhì)壁分離現(xiàn)象；為了使Neo基因能與K基因發(fā)生同源重組，選用限制酶SmaⅠ和BsmⅠ將該基因切下來，然后在該基因的兩側(cè)增加與基因M兩側(cè)相同同源序列的堿基，構(gòu)建具有抗性基因載體．質(zhì)粒pcDNA3上有Neo基因（新霉素抗性基因），故應在添加了新霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)植物細胞，進行篩選．該實驗的目的是研究植物體中還存在著該硫酸鹽降解的支路，故應在添加了新霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述小立碗蘚細胞，若能夠發(fā)育成完整的植物體，則表明該植株已沒有K基因．若通過此轉(zhuǎn)化途徑得到的植株可利用硫酸鹽作為唯一硫源，說明在小立碗蘚中存在PAPS支路．

解答 解：（1）活細胞中葉綠體會隨細胞質(zhì)流動而運動，若發(fā)現(xiàn)在適宜條件下細胞中的葉綠體長時間靜止不動，最可能的原因是 細胞已死亡．
（2）乙同學用小立碗蘚進行了如下實驗操作：
步驟一：制片觀察，在潔凈的載玻片中央加一滴清水，放置一片小立碗蘚的小葉，蓋上蓋玻片．
步驟二：用引流法替換為蔗糖溶液，即從蓋玻片一側(cè)滴入0.3g/mL的蔗糖溶液，在蓋玻片的另一側(cè)用吸水紙吸引，這樣重復幾次．
步驟三：在顯微鏡下觀察，細胞失水后會發(fā)生質(zhì)壁分離，原生質(zhì)層會向中央聚攏，故若發(fā)現(xiàn)葉綠體向細胞中間聚攏，說明細胞已發(fā)生質(zhì)壁分離．
（3）①由于限制酶SmaⅠ的識別序列為回文序列，故可推知在序列“5′…CGACCCGGGAGT…3′”中該酶的識別序列為 CCCGGG．
②為了使Neo基因能與K基因發(fā)生同源重組，選用限制酶SmaⅠ和BsmⅠ將該基因從質(zhì)粒上切下來，然后在該基因的兩側(cè)增加與基因M兩側(cè)相同同源序列的堿基，構(gòu)建具有抗性基因載體．
③去除植物細胞壁采用酶解法，用纖維素酶和果膠酶處理細胞，得到原生質(zhì)體．為防止原生質(zhì)體吸水漲破，應在等滲或微高滲溶液中用PEG做促溶劑，將Neo基因載體導入小立碗蘚細胞內(nèi)．
④該實驗的目的是研究植物體中還存在著該硫酸鹽降解的支路，故應在添加了新霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述小立碗蘚細胞，若能夠發(fā)育成完整的植物體，則表明該植株已沒有K基因．若通過此轉(zhuǎn)化途徑得到的植株可利用硫酸鹽作為唯一硫源，說明在小立碗蘚中存在PAPS支路．
故答案為：
（1）細胞已死亡　
（2）用吸水紙吸引　細胞已發(fā)生質(zhì)壁分離
（3）①CCCGGG　
②SmaⅠ和BsmⅠ同源序列　
③等滲
④新霉素　可利用硫酸鹽作為唯一硫源

點評 本題主要考查細胞觀察、基因工程、構(gòu)建基因表達載體的相關知識，意在考查考生的識圖能力和理解所學知識要點，把握知識間內(nèi)在聯(lián)系的能力；能運用所學知識，對生物學問題作出準確的判斷，難度適中．