Question

5．如表是幾種限制酶識別序列及其切割位點，圖1、圖2標注相關限制酶的酶切位點，其中切割位點相同的酶不重復標注．請回答下列問題：

限制酶	BamHⅠ	BclⅠ	Sau3AⅠ	HindⅢ
識別序列及切割位點

（1）質(zhì)粒作為基因工程的載體，除了圖1中所示的結(jié)構(gòu)條件外，還需要具備終止子、復制原點．用圖中質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒，應選用BclⅠ和HindⅢ兩種限制酶切割．若用Sau3A I切圖1質(zhì)粒最多可能獲得7種大小不同的DNA片段．
（2）為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，應在篩選平板培養(yǎng)基中添加四環(huán)素．
（3）為了在體外擴增目的基因，可采用聚合酶鏈式反應，該反應體系需要模板、緩沖液、引物、dNTP和Taq酶．為獲得圖2中的目的基因，所用的引物不會是引物乙，引物在退火階段，與DNA模板按堿基互補配對原則結(jié)合．

Answer 1

分析 解答本題的關鍵在于理解重組質(zhì)粒中標記基因的作用．選擇限制酶需注意插入目的基因時不能破壞標記基因．PCR擴增基因時，兩種引物結(jié)合的部位相反，延伸的方向相反．限制酶具有特異性，不同的限制酶識別不同的序列，判斷某種限制酶能否切割片斷，應該據(jù)該片段中是否含有限制酶的識別序列．
根據(jù)題意和圖示分析可知：在質(zhì)粒上存在BamH I、BclⅠ、BamH I和HindⅢ等四個酶切位點，其中BamH I的切割位點在兩個抗性基因上都有，而抗性基因為載體的標記基因，因此不可用該酶切割．在目的基因上，BclⅠ、BamH I、HindⅢ和Sau3AⅠ四種酶也存在酶切位點．

解答 解：（1）質(zhì)粒作為基因工程的載體，需要具有啟動子、終止子、標記基因、復制原點等條件，圖1中具有啟動子和標記基因．選擇的限制酶應在目的基因兩端存在識別位點，但BamHⅠ可能使質(zhì)粒中的啟動子丟失，因此只能選BclI和HindⅢ兩種限制酶切割．根據(jù)BamHⅠ、BclI和Sau3A I的酶切位點，Sau3A I在質(zhì)粒上有三個酶切位點，完全酶切可得到記為A、B、C三種片段，若部分位點被切開，可得到AB、AC、BC、ABC四種片段，所以用Sau3A I切圖1質(zhì)粒最多可能獲得7種大小不同的DNA片段．
（2）為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，根據(jù)質(zhì)粒上的抗性基因，應在篩選平板培養(yǎng)基中添加四環(huán)素．
（3）為了在體外擴增目的基因，可采用聚合酶鏈式反應，該反應體系需要模板、緩沖液、引物、dNTP和Taq酶．PCR技術要求兩種引物分別和目的基因的兩條單鏈結(jié)合，沿相反的方向合成子鏈，故所用的引物組成為圖2中引物甲和引物丙．引物在退火階段，與DNA模板按堿基互補配對原則結(jié)合．
故答案為：
（1）終止子、復制原點     BclⅠ和HindⅢ7
（2）四環(huán)素
（3）聚合酶鏈式     Taq酶     引物乙     堿基互補配對

點評 本題考查基因工程的相關知識，要求考生識記基因工程的原理及操作步驟，掌握各操作步驟的相關細節(jié)，能結(jié)合所學的知識準確答題，屬于考綱應用和理解層次的考查．