Question

5．如表是幾種限制酶識(shí)別序列及其切割位點(diǎn)，圖1、圖2標(biāo)注相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)，其中切割位點(diǎn)相同的酶不重復(fù)標(biāo)注．請(qǐng)回答下列問題：

限制酶	BamHⅠ	BclⅠ	Sau3AⅠ	HindⅢ
識(shí)別序列及切割位點(diǎn)

（1）質(zhì)粒作為基因工程的載體，除了圖1中所示的結(jié)構(gòu)條件外，還需要具備終止子、復(fù)制原點(diǎn)．用圖中質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒，應(yīng)選用BclⅠ和HindⅢ兩種限制酶切割．若用Sau3A I切圖1質(zhì)粒最多可能獲得7種大小不同的DNA片段．
（2）為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中添加四環(huán)素．
（3）為了在體外擴(kuò)增目的基因，可采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，該反應(yīng)體系需要模板、緩沖液、引物、dNTP和Taq酶．為獲得圖2中的目的基因，所用的引物不會(huì)是引物乙，引物在退火階段，與DNA模板按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則結(jié)合．

Answer 1

分析 解答本題的關(guān)鍵在于理解重組質(zhì)粒中標(biāo)記基因的作用．選擇限制酶需注意插入目的基因時(shí)不能破壞標(biāo)記基因．PCR擴(kuò)增基因時(shí)，兩種引物結(jié)合的部位相反，延伸的方向相反．限制酶具有特異性，不同的限制酶識(shí)別不同的序列，判斷某種限制酶能否切割片斷，應(yīng)該據(jù)該片段中是否含有限制酶的識(shí)別序列．
根據(jù)題意和圖示分析可知：在質(zhì)粒上存在BamH I、BclⅠ、BamH I和HindⅢ等四個(gè)酶切位點(diǎn)，其中BamH I的切割位點(diǎn)在兩個(gè)抗性基因上都有，而抗性基因?yàn)檩d體的標(biāo)記基因，因此不可用該酶切割．在目的基因上，BclⅠ、BamH I、HindⅢ和Sau3AⅠ四種酶也存在酶切位點(diǎn)．

解答 解：（1）質(zhì)粒作為基因工程的載體，需要具有啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因、復(fù)制原點(diǎn)等條件，圖1中具有啟動(dòng)子和標(biāo)記基因．選擇的限制酶應(yīng)在目的基因兩端存在識(shí)別位點(diǎn)，但BamHⅠ可能使質(zhì)粒中的啟動(dòng)子丟失，因此只能選BclI和HindⅢ兩種限制酶切割．根據(jù)BamHⅠ、BclI和Sau3A I的酶切位點(diǎn)，Sau3A I在質(zhì)粒上有三個(gè)酶切位點(diǎn)，完全酶切可得到記為A、B、C三種片段，若部分位點(diǎn)被切開，可得到AB、AC、BC、ABC四種片段，所以用Sau3A I切圖1質(zhì)粒最多可能獲得7種大小不同的DNA片段．
（2）為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，根據(jù)質(zhì)粒上的抗性基因，應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中添加四環(huán)素．
（3）為了在體外擴(kuò)增目的基因，可采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，該反應(yīng)體系需要模板、緩沖液、引物、dNTP和Taq酶．PCR技術(shù)要求兩種引物分別和目的基因的兩條單鏈結(jié)合，沿相反的方向合成子鏈，故所用的引物組成為圖2中引物甲和引物丙．引物在退火階段，與DNA模板按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則結(jié)合．
故答案為：
（1）終止子、復(fù)制原點(diǎn)     BclⅠ和HindⅢ7
（2）四環(huán)素
（3）聚合酶鏈?zhǔn)?nbsp;    Taq酶     引物乙     堿基互補(bǔ)配對(duì)

點(diǎn)評(píng) 本題考查基因工程的相關(guān)知識(shí)，要求考生識(shí)記基因工程的原理及操作步驟，掌握各操作步驟的相關(guān)細(xì)節(jié)，能結(jié)合所學(xué)的知識(shí)準(zhǔn)確答題，屬于考綱應(yīng)用和理解層次的考查．